[發明專利]一種制備豬圓環病毒2型滅活疫苗的方法

有效

• 申請號: 201210578150.1
• 申請日: 2012-12-27
• 公開（公告）號: CN103285385A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 呂蔚;徐倩倩;劉濤;鄭朝朝;郁宏偉;楊保收;李亞杰;柳珊;趙玉龍
• 申請（專利權）人: 瑞普（保定）生物藥業有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/20;C12N7/02
• 代理公司: 石家莊冀科專利商標事務所有限公司 13108
• 代理人: 李羨民;高錫明

1.一種制備豬圓環病毒2型滅活疫苗的方法，其特征在于：它利用激流灌注式生物反應器為培養系統，所述激流灌注式生物反應器包括第一蠕動泵（1）、第二蠕動泵（2），第一硅膠管（3）、第二硅膠管（4）、激流罐（5）、灌注袋（6）、有孔硅膠管（7）和聚酯纖維紙片載體（8）；所述灌注袋（6）為內含聚酯纖維紙片載體的細胞培養袋，兩個灌注袋結構與功能完全相同，以相同的方式與激流罐（5）連接，通過外源泵實現物質交換；

滅活疫苗的制備按以下步驟進行：

a.制苗用細胞的培養

將細胞懸液即種子細胞和細胞生長液混合液接種至激流灌注式生物反應器的灌注袋（6），使細胞貼附在聚酯纖維紙片載體（8）上。接種密度為：每克載體接種0.8～1.2×10⁷個細胞，設定設備參數：溫度T1：37.5～38℃、T2：43～46℃、T3：35.5～37℃，pH：7.2～7.6，DO：40%～70%、振蕩速度30～45rpm，空氣流量100ml/min～1000ml/min，啟動細胞培養程序，進行細胞培養，得到制苗用細胞；

b.病毒接種與培養

當細胞單日耗糖趨于平穩時，表明細胞達到接毒要求，排空反應器內液體，將豬圓環病毒2型種毒接種至制苗用細胞，設定設備參數：溫度T1：37～38℃、T2：41～44℃、T3：34～36℃，pH：7.3～7.6，DO：40%～70%，振蕩速度35~45r/min，空氣流量100ml/min～1000ml/min，啟動病毒培養程序，擴增培養豬圓環病毒2型；

c.病毒液收獲

病毒培養40～42h后，收獲激流罐（5）與灌注袋（6）內的病毒液，將灌注袋（6）反復凍融2～3次后收獲上清液，混合后-20℃保存備用；檢測病毒液效價；

d.病毒液滅活

按V:V?1:2000向收獲的病毒液中加入β-丙內酯滅活劑，滅活病毒；

e.疫苗制備

滅活的病毒液加入佐劑，乳化制備成豬圓環病毒2型滅活疫苗。

2.根據權利要求1所述的制備豬圓環病毒2型滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟a中，種子細胞為豬腎細胞PK15，為經過有限稀釋法克隆純化篩選的細胞，應用有限稀釋法將待篩選細胞進行單克隆化，擴大培養建立單克隆化細胞庫，通過TCID₅₀篩選豬圓環病毒2型疫苗株的高適應性單克隆化細胞株。

3.根據權利要求2所述的制備豬圓環病毒2型滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟a中，細胞培養過程中采用階段流加方式補充細胞生長液，當殘糖量低于2g/L時，流加補充細胞生長液，流加量以培養液含糖量不低于1g/L為準，當培養液體積達到有效培養體積時，進行換液。

4.根據權利要求3所述的制備豬圓環病毒2型滅活疫苗的方法，步驟a中，逐日增大空氣流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min。

5.根據權利要求4所述的制備豬圓環病毒2型滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟b中，病毒接種前將種毒混于細胞維持液中，種毒與細胞維持液按V/V為1%～3%混合，病毒接種時將混有病毒液的細胞維持液泵入反應器系統中，無需吸附，直接啟動病毒培養程序擴增培養病毒。

6.根據權利要求5所述的制備豬圓環病毒2型滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟b中，病毒培養12h時開始持續流加補充n倍濃縮DMEM液和200g/L葡萄糖，流加速度以培養液殘糖量不低于1g/L為準；所述n等于2～5。

7.根據權利要求6所述的制備豬圓環病毒2型滅活疫苗的方法，其特征在于，所述n倍濃縮DMEM液配制方法為：1份DMEM干粉培養基按照使用說明書用量加入去離子水配置成1×DMEM液后，再加入（n-1）份無Na-DMEM干粉培養基，溶解即成；所述n等于2～5。

8.根據權利要求7所述的制備豬圓環病毒2型滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟e中，在滅活的病毒液中按水相與油相佐劑V/V?3:1緩慢加入ISA?28?VG或MF59劑，乳化制備成水包油型豬圓環病毒2型滅活疫苗。