[發明專利]一種制備狂犬病疫苗的方法

有效

• 申請號: 201210578077.8
• 申請日: 2012-12-27
• 公開（公告）號: CN103285390A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 邱貞娜;劉濤;鄭朝朝;郁宏偉;柳珊;韓佳麗;楊保收;梁武;李建麗
• 申請（專利權）人: 瑞普（保定）生物藥業有限公司
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;A61K39/205;A61P31/14;A61P31/22;C12M3/00
• 代理公司: 石家莊冀科專利商標事務所有限公司 13108
• 代理人: 李羨民;高錫明

技術領域

本發明涉及一種利用激流灌注式生物反應器制備狂犬病疫苗的方法，屬于生物技術領域?

背景技術

狂犬病是由狂犬病病毒引起的所有溫血動物都易感的人獸共患病，該病在世界范圍內發生和流行，狂犬病病毒通過動物咬傷及抓傷而傳播，病毒侵害動物和人的神經系統，一旦發病，死亡率約為100%。我國是世界上狂犬病的高發地區，狂犬病死亡人數在我國法定報告傳染病中始終占據首位，是危害我國公共衛生安全的重大疫病。?

犬、貓在攜帶和傳播狂犬病中起重要作用，是人畜感染狂犬病病毒的最主要的來源。提高犬、貓等動物的狂犬病疫苗免疫率，是從根本上預防狂犬病的發生，控制和消滅狂犬病的必經之路。而高質量的獸用狂犬病疫苗是保障免疫成功的基礎。?

傳統的狂犬病疫苗生產工藝為轉瓶生產，具有生產病毒滴度低、勞動強度大、批間差異大等缺點。近幾年，隨著獸用疫苗行業的發展，生物反應器的應用研究越來越被重視，利用不同類型的生物反應器開發的多種培養工藝被相繼報道。在狂犬病疫苗生產中，機械攪拌式生物反應器實現了全懸浮培養BHK21細胞和球狀微載體培養貼壁BHK21細胞兩種培養工藝，潮汐式生物反應器實現了紙片載體培養貼壁BHK21細胞的培養工藝。?

從行業整體發展來看，應用生物反應器生產狂犬病疫苗比轉瓶工藝有很大的進步，但在生產工藝優化與成本控制等方面均有很大的發展空間。應用激流灌注式生物反應器生產狂犬病疫苗的研究未見報道。?

發明內容

本發明的目的是提供一種利用激流灌注式生物反應器制備狂犬病疫苗的方法。由以下技術方案實現的：?

一種制備狂犬病疫苗的方法，它利用激流灌注式生物反應器作為培養工具，所述激流灌注式生物反應器包括第一蠕動泵、第二蠕動泵、第三蠕動泵、第一硅膠管、第二硅膠管、第三硅膠管、有孔硅膠管、紙片載體、灌注袋、混勻器與激流罐；其中，混勻器是具有加熱或保溫功能、并能對內部液體進行混勻的罐狀裝置；所述反應器中液體的流向為：灌注袋——硅膠管——混勻器——硅膠管——激流罐——硅膠管——灌注袋；

疫苗制備按以下步驟進行：

a、細胞接種

將細胞懸液即BHK21細胞和細胞生長液混合液接種至激流灌注式生物反應器的灌注袋（9），使細胞貼附在聚酯纖維紙片載體（8）上，細胞接種密度為：每克載體接種0.8～1.5×10⁷個細胞；

b、制苗用細胞培養

設定設備參數：溫度T1：37～37.5℃、T2：40～45℃、T3：34～36℃，pH：7.0～7.4，DO：40%～70%，振蕩速度15～30r/min，空氣流量100ml/min～1000ml/min，啟動細胞培養程序，進行細胞培養，得到制苗用細胞；

c、病毒接種

當細胞單日耗糖趨于平穩時，表明細胞達到接毒要求，排空反應器內液體，將狂犬病病毒種毒接種制苗用細胞，接種劑量為有效培養體積的0.3%～1%（V/V），吸附15～30min；加入細胞維持液；

d、病毒培養

設定設備參數：溫度T1：32～35℃、T2：37～40℃、T3：30～33℃，pH：7.2～7.6，DO：40%～70%，振蕩速度15～25r/min，空氣流量400ml/min～4000ml/min，啟動病毒培養程序，擴增培養狂犬病病毒；

e、病毒液收獲

接毒后72～96h開始，多批次收獲病毒液；0.5微米濾膜過濾病毒液后，保存備用；

f、疫苗制備

將收獲病毒液制備狂犬病活疫苗或狂犬病滅活疫苗。

上述制備狂犬病疫苗的方法，所述步驟b中，細胞培養過程中采用階段流加方式補充細胞生長液，當殘糖量低于1.5g/L時，流加補充細胞生長液，流加速度以培養液含糖量維持在1.5～2g/L之間為準，當培養液體積達到有效培養體積時，更換培養液。?

上述制備狂犬病疫苗的方法，所述步驟b中，逐日增加空氣流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min。?

上述制備狂犬病疫苗的方法，所述步驟c中，狂犬病病毒是回歸鼠腦后，再經BHK21細胞傳代適應的復壯毒；?

上述制備狂犬病疫苗的方法，所述步驟d中，接毒15h后開始持續流加補充n倍濃縮DMEM液，流加速度以培養液殘糖量維持在1～2g/L之間為準；所述n等于2～5。