[發明專利]一種制備狂犬病疫苗的方法

有效

• 申請號: 201210578077.8
• 申請日: 2012-12-27
• 公開（公告）號: CN103285390A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 邱貞娜;劉濤;鄭朝朝;郁宏偉;柳珊;韓佳麗;楊保收;梁武;李建麗
• 申請（專利權）人: 瑞普（保定）生物藥業有限公司
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;A61K39/205;A61P31/14;A61P31/22;C12M3/00
• 代理公司: 石家莊冀科專利商標事務所有限公司 13108
• 代理人: 李羨民;高錫明

1.一種制備狂犬病疫苗的方法，其特征在于：它利用激流灌注式生物反應器作為培養工具，所述激流灌注式生物反應器包括第一蠕動泵（1）、第二蠕動泵（2）、第三蠕動泵（3）、第一硅膠管（4）、第二硅膠管（5）、第三硅膠管（6）、有孔硅膠管（7）、紙片載體（8）、灌注袋（9）、混勻器（10）與激流罐（11）；其中，混勻器（10）是具有加熱或保溫功能、并能對內部液體進行混勻的罐狀裝置；所述反應器中液體的流向為：灌注袋（9）——硅膠管（4）——混勻器（10）——硅膠管（5）——激流罐（11）——硅膠管（6）——灌注袋（9）；

疫苗制備按以下步驟進行：

a、細胞接種

將細胞懸液即BHK21細胞和細胞生長液混合液接種至激流灌注式生物反應器的灌注袋（9），使細胞貼附在聚酯纖維紙片載體（8）上，細胞接種密度為：每克載體接種0.8～1.5×10⁷個細胞；

b、制苗用細胞培養

設定設備參數：溫度T1：37～37.5℃、T2：40～45℃、T3：34～36℃，pH：7.0～7.4，DO：40%～70%，振蕩速度15～30r/min，空氣流量100ml/min～1000ml/min，啟動細胞培養程序，進行細胞培養，得到制苗用細胞；

c、病毒接種

當細胞單日耗糖趨于平穩時，表明細胞達到接毒要求，排空反應器內液體，將狂犬病病毒種毒接種制苗用細胞，接種劑量為有效培養體積的0.3%～1%（V/V），吸附15～30min；加入細胞維持液；

d、病毒培養

設定設備參數：溫度T1：32～35℃、T2：37～40℃、T3：30～33℃，pH：7.2～7.6，DO：40%～70%，振蕩速度15～25r/min，空氣流量400ml/min～4000ml/min，啟動病毒培養程序，擴增培養狂犬病病毒；

e、病毒液收獲

接毒后72～96h開始，多批次收獲病毒液；0.5微米濾膜過濾病毒液后，保存備用；

f、疫苗制備

將收獲病毒液制備狂犬病活疫苗或狂犬病滅活疫苗。

2.根據權利要求1所述制備狂犬病疫苗的方法，其特征在于，所述步驟b中，細胞培養過程中采用階段流加方式補充細胞生長液，當殘糖量低于1.5g/L時，流加補充細胞生長液，流加速度以培養液含糖量維持在1.5～2g/L之間為準，當培養液體積達到有效培養體積時，更換培養液。

3.根據權利要求2所述制備狂犬病疫苗的方法，其特征在于，所述步驟b中，逐日增加空氣流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min。

4.根據權利要求3所述制備狂犬病疫苗的方法，其特征在于，所述步驟c中，狂犬病病毒是回歸鼠腦后、再經BHK21細胞傳代適應的復壯毒。

5.根據權利要求4所述制備狂犬病疫苗的方法，其特征在于，所述步驟d中，接毒15h后開始持續流加補充n倍濃縮DMEM液，流加速度以培養液殘糖量維持在1～2g/L之間為準；所述n等于2～5。

6.根據權利要求5所述制備狂犬病疫苗的方法，其特征在于，所述n倍濃縮DMEM液配制方法為：1份DMEM干粉培養基按照使用說明書用量加入去離子水配置成1×DMEM液后，再加入（n-1）份無Na-DMEM干粉培養基，溶解即成；所述n等于2～5。

7.根據權利要求6所述制備狂犬病疫苗的方法，其特征在于，所述步驟e中，收獲方式為多批次收獲；第一次收獲時間為接毒后72～96h，之后每36～48h收獲一次，持續收獲6～8次；每次收獲量為培養液總體積的80%～100%。