[發明專利]一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的快速純化方法

有效

• 申請號: 201210576754.2
• 申請日: 2012-12-26
• 公開（公告）號: CN103013932A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 李登峰
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術領域

本發明涉及病毒的純化方法，尤其是涉及一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的快速純化方法。

背景技術

呼腸孤病毒（Reovirus）是一類宿主范圍非常廣泛的病毒，其宿主可涵蓋哺乳動物、禽類、昆蟲、水生動物等。水生呼腸孤病毒是感染水生生物的一類呼腸孤病毒。Meyers等于1979年首次從美國牡蠣中分離到了水生呼腸孤病毒。迄今為止分離鑒定出了40余株水生呼腸孤病毒，這種病毒主要通過呼吸、腸道感染宿主，導致出血病和肝臟與胰臟疾病，在全球范圍內對水產養殖業造成了嚴重的威脅。水生呼腸孤病毒是水生動物中普遍存在的病毒，在魚、蝦、蟹中均有報道。

三疣梭子蟹是我國重要的水產養殖品種，在我國的江浙、兩廣、福建等地已經開始成功的規?；B殖。隨著養殖規模的擴大，各種病害頻繁爆發，三疣梭子蟹病害的病原有細菌、真菌、病毒和寄生蟲等，有報道的能感染三疣梭子蟹的病毒主要是皰疹病毒科的皰疹狀病毒（HLV）以及小RNA病毒科的小核糖核酸病毒，另外，還存在著對蝦白斑病毒對三疣梭子蟹的感染情況。呼腸孤病毒作為水生動物病毒中宿主較廣泛的病毒之一在蟹類中的發現早就已經見諸報道，但還沒有在三疣梭子蟹中發現呼腸孤病毒的相關報道。實驗室研究人員在對三疣梭子蟹養殖場中患病螃蟹進行病原檢測的過程中，從患病的三疣梭子蟹體內檢測到了呼腸孤病毒的存在，通過人工感染實驗等研究確定其為秋冬季梭子蟹大量死亡的主要病原，該病毒給三疣梭子蟹的養殖帶來了巨大的損失。因此對三疣梭子蟹呼腸孤病毒的致病機理及其防治展開及時深入的研究顯得非常的緊迫。對三疣梭子蟹呼腸孤病毒展開一系列的研究總是存在著有效率生產病毒的需要，以便分離和純化病毒蛋白，制備疫苗、或提供實驗室研究的感染性病毒。另外，高效率的生產感染性病毒對病毒疾病的治療的推動具有積極的作用。同時以本發明技術為基礎，推廣至各類蟹組織中病毒的快速純化具有一定的應用價值。

目前在病毒純化技術領域存在的問題主要有儀器設備與技術要求高，操作麻煩等特點。如在授權公告號為CN101098959A公開日期為2008年1月2日，發明名稱為改進的病毒純化方法中所描述的方法，涉及到了離子交換和大小排阻色譜等技術，離子交換需要不同樹脂的離子交換柱，而且在過柱之前還要經過提取、過濾和濃縮等步驟，在基于大小差異來純化病毒的方法中采用的大小排阻色譜柱使用前需要先使用陰離子交換柱，雖然經過這些方法純化的病毒產率、純度和規模都能達到良好的效果，但是設備要求很高、成本也不低，而且操作繁瑣，不適合于一般實驗室中使用。在一般常見的CsCl密度梯度超速離心與蔗糖密度超速離心等方法中對離心機的轉速要求上也很嚴格。因此，現有的蟹類病毒純化中存在著儀器設備要求高，操作麻煩、成本高等困難。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種高效、快速、簡便、低成本的三疣梭子蟹呼腸孤病毒的純化方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的純化方法，采用多次差速離心的純化方式純化病毒，具體步驟如下：

(1)?取患病死亡的三疣梭子蟹解剖，取內臟與鰓剪碎后，置于預先冰浴過的8-10倍體積的高鹽TNE2緩沖液中，勻漿直至完全碎裂；

(2)?將勻漿后的組織懸液分裝于50ml離心管中，4℃?6000g離心10min，收集上清液，將離心所得沉淀的用高鹽TNE2緩沖液重懸，再次勻漿，4℃?6000g?10min離心，收集上清液；將兩次離心所得上清液合并；

(3)?將合并后的上清液經8000g，4℃?離心20min，取上清液；

(4)?將步驟（3）得到上清液于4℃?，35000g離心1.5h，將離心所得的沉淀的上層疏松部分用TM2緩沖液小心沖洗掉，下層白色沉淀部分重懸于1-3ml的TM2緩沖液中，4℃冰浴過夜；

(5)?將浸泡后的下層白色沉淀部分重新完全懸浮起來，4℃下3500g離心5min，棄去沉淀；取上清液于4℃下，38000g離心1.5h；將離心得到的沉淀上層疏松部分用TM2緩沖液小心沖洗掉，下層結實的純白色部分即純化的三疣梭子蟹呼腸孤病毒粒子。

所述的高鹽TNE2緩沖液的各組分濃度為：50?mM?Tris-HCl，400?mM?NaCl，5?mM?EDTA，1mM的蛋白酶抑制劑，pH為8.5。

所述的TM2緩沖液各組分濃度為：50?mM?Tris-HCl，10?mM?MgCl2，260mM?NaCl，1mM的蛋白酶抑制劑，pH?為7.5。由于梭子蟹是海洋生物，而且具有開放式循環系統，所以它用到的緩沖溶液鹽離子濃度需要提高。