[發明專利]一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的快速純化方法

有效

• 申請號: 201210576754.2
• 申請日: 2012-12-26
• 公開（公告）號: CN103013932A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 李登峰
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的純化方法，其特征在于采用多次差速離心的純化方式純化病毒，具體步驟如下：

(1)?取患病死亡的三疣梭子蟹解剖，取內臟與鰓剪碎后，置于預先冰浴過的8-10倍體積的高鹽TNE2緩沖液中，勻漿直至完全碎裂；

(2)?將勻漿后的組織懸液分裝于50ml離心管中，4℃?6000g離心10min，收集上清液，將離心所得沉淀的用高鹽TNE2緩沖液重懸，再次勻漿數分鐘，4℃?6000g?10min離心，收集上清液；將兩次離心所得上清液合并；

(3)?將合并后的上清液經8000g，4℃?離心20min，取上清液；

(4)?將步驟（3）得到上清液于4℃?，35000g離心1.5h，將離心所得的沉淀的上層疏松部分用TM2緩沖液小心沖洗掉，下層白色部分重懸于1-3ml的TM2緩沖液中，4℃冰浴過夜；

(5)?將浸泡后的下層白色沉淀部分重新完全懸浮起來，4℃下3500g離心5min，棄去沉淀；取上清液于4℃下，38000g離心1.5h；將離心得到的沉淀上層疏松部分用TM緩沖液小心沖洗掉，下層結實的純白色部分即純化的三疣梭子蟹呼腸孤病毒粒子。

2.根據權利要求1所述的一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的純化方法，其特征在于：所述的高鹽TNE2緩沖液的各組分濃度為：50?mM?Tris-HCl，400?mM?NaCl，5?mM?EDTA，1mM的蛋白酶抑制劑，pH為8.5。

3.根據權利要求1所述的一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒的純化方法，其特征在于：所述的TM2緩沖液各組分濃度為：50?mM?Tris-HCl，10?mM?MgCl₂，260mM?NaCl,?1mM的蛋白酶抑制劑，pH?為7.5。