[發明專利]乳膠半固體培養基及其制備方法和雜交瘤細胞篩選方法

有效

• 申請號: 201210575609.2
• 申請日: 2012-12-26
• 公開（公告）號: CN103898062A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 萬曉春;劉婕;金言
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;G01N33/569
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

技術領域

本發明涉及細胞工程領域，尤其是涉及一種乳膠半固體培養基及其制備方法和雜交瘤細胞篩選方法。

背景技術

抗體主要是由B淋巴細胞合成，每個B淋巴細胞均含有合成一種抗體的遺傳基因。當機體受刺激時，抗原分子上的許多抗原決定簇分別激活各個具有不同基因的B淋巴細胞。將激活的單一B淋巴細胞進行培養，得到由單細胞經分裂增殖而形成細胞群，稱為單克隆。單克隆細胞合成針對一種抗原決定簇的抗體，即單克隆抗體（簡稱單抗）。

1975年德國學者Kohler和英國學者Milstein將小鼠骨髓瘤細胞核經綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞在體外進行兩種細胞的融合，形成雜交瘤（hybridoma）細胞，這種細胞繼承兩種親代細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞無限繁殖的特性，又具有合成和分泌抗體的能力。用這種來源于單個融合細胞增殖的細胞群，可制備針對一種抗原決定簇的特異性單克隆抗體。時至今日單克隆抗體技術被不斷日臻完善，但有一個問題一直困擾著單抗制備的研究人員和制約著單抗的通量化和規模化生產，即如何減少單抗制備過程中的人力成本，縮短單抗制備所需要的時間，從而降低單個單抗制備的成本。

雜交瘤細胞所分泌的抗體-單克隆抗體是目前認為的最為成熟與可靠的分子識別工具，被廣泛應用于生物學研究的各個領域。然而由于雜交瘤細胞株的制備周期長，所需的勞動強度高，已經成為制約雜交瘤細胞制備的重要瓶頸之一。單抗制備過程中最重要也是最為需要人力資源的一步是分泌特異性抗體的篩選工作，好的篩選方案是單克隆抗體制備成功與否的關鍵，傳統通用的篩選方法是通過固相酶聯免疫（ELISA）法進行篩選，從成千上萬個融合后的雜交瘤細胞中篩選分泌特異性抗體的雜交瘤細胞，隨著制備過程的進行，有些不穩定的雜交瘤細胞失去了分泌特異性抗體的功能，在制備的末期甚至會失去全部的分泌特異性抗體的雜交瘤，導致單抗制備的失敗。幾十年來在篩選的方法上也存在眾多的改進，如通過流式細胞儀對雜交瘤細胞所分泌的抗體進行篩選，可以篩選出親和力較高的抗細菌膜抗原的單抗，近年來，蛋白芯片技術的不斷成熟也為單抗的篩選提供了一些新的方法，Sawyer利用蛋白芯片結合多蛋白的復合免疫，進行單抗制備，取得了較好的結果。但所有這些改進，對于篩選中工作量的降低都不明顯。

單抗制備過程中的另外一個需要工作量較大的部分是克隆化培養，常用的方法是有限稀釋法，由于雜交瘤細胞的基因組的不穩定性，使得其在后續的培養中，會發生染色體丟失現象，即使雜交瘤細胞在建株后，仍可能會丟失編碼抗體的染色體，使雜交瘤細胞失去分泌特異性抗體的能力。因此，在單抗制備初期，人們總是盡可能多的將所有陽性細胞進行克隆化培養，以期最大限度的保留分泌特異性抗體的雜交瘤細胞，從而造成了巨大工作量。有限稀釋法不僅勞動強度大，周期長，而且也需要很豐富的克隆篩選經驗，嚴格把握好亞克隆的時間，操作繁瑣。

發明內容

基于此，有必要提供一種使雜交瘤細胞篩選培養周期較短、操作簡便的乳膠半固體培養基及其制備方法。

一種乳膠半固體培養基，包括如下體積份數的各組分：

濃度為0.4g/ml的甲基纖維素溶液???????????????????????10；

pH7.0~7.4的2×1640培養基????????????????????????????18；

濃度為1mol/l的L-谷氨酰胺溶液????????????????????????0.16；

濃度為1mmol/l的β-巰基乙醇溶液??????????????????????0.5；

胎牛血清????????????????????????????????????????????10；

10000單位/ml的青霉素與10000μg/ml鏈霉素混合溶液?????0.4；

50×HAT溶液?????????????????????????????????????????0.8；及

乳膠抗原顆粒溶液????????????????????????????????????1；

其中，每毫升所述乳膠抗原顆粒溶液中包括50μg的抗原、0.1ml質量分數為10%的聚苯乙烯乳膠溶液及0.9ml0.1mmol/l的磷酸鹽磷酸鹽緩沖液。

在其中一個實施例中，所述甲基纖維素為4000cp的甲基纖維素。

在其中一個實施例中，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.4。

一種乳膠半固體培養基的制備方法，包括如下步驟：