[發明專利]乳膠半固體培養基及其制備方法和雜交瘤細胞篩選方法

有效

• 申請號: 201210575609.2
• 申請日: 2012-12-26
• 公開（公告）號: CN103898062A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 萬曉春;劉婕;金言
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;G01N33/569
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

1.一種乳膠半固體培養基，其特征在于，包括如下體積份數的各組分：

濃度為0.4g/ml的甲基纖維素溶液??????????????????????????????10；

pH??7.0~7.4的2×1640培養基?????????????????????????????????18；

濃度為1mol/l的L-谷氨酰胺溶液???????????????????????????????0.16；

濃度為1mmol/l的β-巰基乙醇溶液?????????????????????????????0.5；

胎牛血清???????????????????????????????????????????????????10；

10000單位/ml的青霉素與10000μg/ml鏈霉素混合溶液????????????0.4；

50×HAT溶液????????????????????????????????????????????????0.8；及

乳膠抗原顆粒溶液???????????????????????????????????????????1；

其中，每毫升所述乳膠抗原顆粒溶液中包括50μg的抗原、0.1ml質量分數為10%的聚苯乙烯乳膠溶液及0.9ml0.1mmol/l的磷酸鹽磷酸鹽緩沖液。

2.如權利要求1所述的乳膠半固體培養基，其特征在于，所述甲基纖維素為4000cp的甲基纖維素。

3.如權利要求1所述的乳膠半固體培養基，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的pH為8.4。

4.一種乳膠半固體培養基的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

分別制備濃度為0.4g/ml的甲基纖維素溶液、pH7.0~7.4的2×1640培養基、濃度為1mol/l的L-谷氨酰胺溶液及濃度為1mmol/l的β-巰基乙醇溶液；

將抗原用0.1mmol/l的磷酸鹽緩沖液稀釋至100μg/ml，取質量分數為10%的聚苯乙烯乳膠用0.1mmol/l的磷酸鹽緩沖液以1:5的比例稀釋，然后將稀釋的聚苯乙烯乳膠溶液與稀釋的抗原溶液等體積混合，37℃下靜置1小時，得到乳膠抗原顆粒溶液；

向所述甲基纖維素溶液中依次加入所述2×1640培養基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述β-巰基乙醇溶液、胎牛血清、10000單位/ml的青霉素與10000μg/ml鏈霉素混合溶液、50×HAT溶液及所述乳膠抗原顆粒溶液，4℃下攪拌均勻得到所述乳膠半固體培養基，其中，所述甲基纖維素溶液、所述2×1640培養基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述胎牛血清、所述10000單位/ml的青霉素與10000μg/ml鏈霉素混合溶液、所述50×HAT溶液及所述乳膠抗原顆粒溶液的體積比為10:18:0.16:0.5:10:0.4:0.8:1。

5.如權利要求4所述的乳膠半固體培養基的制備方法，其特征在于，所述甲基纖維素為4000cp的甲基纖維素。

6.如權利要求4所述的乳膠半固體培養基的制備方法，其特征在于，所述磷酸鹽磷酸鹽緩沖液的pH為7.4。

7.一種雜交瘤細胞的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：

按照權利要求4-6任一項所述的乳膠半固體培養基的制備方法制備所述乳膠半固體培養基；

將融合后的雜交瘤細胞于37℃下預培養16~24小時后轉入所述乳膠半固體培養基中，混勻后，加入堿性成纖維細胞生長因子5ng/ml和雜交瘤細胞融合克隆因子15ul/ml，混勻，分裝在37℃、5%體積的CO₂條件下培養；

培養7~14天后，待長出可見的單克隆菌落時，在體式顯微鏡下用微量移液器將具有顏色反應的克隆株移至多微孔板中用液體培養的方法放大培養，每孔移入1個克隆進行細胞凍存培養，即可篩選出所述雜交瘤細胞。