[發明專利]引物及該引物質譜檢測PIK3CA基因熱點突變的方法

有效

• 申請號: 201210574584.4
• 申請日: 2012-12-26
• 公開（公告）號: CN103013993A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 郝瑋;陳然;張聰;李金歡;李小青;周蕊;梁超;韓韜;黃士昂;涂贊兵;陳忠;方國偉
• 申請（專利權）人: 武漢康圣達醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 鄭自群

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，特別是涉及引物及該引物質譜檢測PIK3CA基因熱點突變的方法。

背景技術

（1）、單核苷酸多態性

單核苷酸多態性(single?nucleotide?polymorphism，SNP),主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。SNP所表現的多態性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。一般而言,SNP是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異。SNP成為第三代遺傳標志,人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關。大量存在的SNP位點，使人們有機會發現與各種疾病，包括腫瘤相關的基因組突變；從實驗操作來看，通過SNP發現疾病相關基因突變要比通過家系來得容易；有些SNP并不直接導致疾病基因的表達，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標記。SNP將提供一個強有力的工具，用于高危群體的發現、疾病相關基因的鑒定、藥物的設計和測試以及生物學的基礎研究等。SNP研究是人類基因組計劃走向應用的重要步驟。

（2）、PIK3CA基因

PIK3CA是PI3K家族的關鍵成員-IA類磷脂酰肌醇-3激酶的p110α催化亞基。PIK3CA是一個34kb的基因，定位于染色體3q26.32，含20個外顯子，編碼1068個氨基酸，生成124kDa蛋白質，它是逆轉錄病毒v-p3k癌基因在細胞內的同系物。PIK3CA的功能是催化4,5-PIP2成為3,4,5-PIP3。研究已經發現在多種人類癌癥（結腸癌，乳癌，腦癌，肝癌，胃癌和肺癌等）中存在PIK3CA的擴增、缺失、及體細胞突變。體細胞突變的PIK3CA其激酶活性增加并導致細胞轉化。PIK3CA基因在癌癥中呈現高頻突變：人們對PIK3CA在多種癌癥中的突變進行了檢測，大量的數據表明PIK3CA有3個熱點突變區，即第9外顯子的E542K和E545K，以及第20號外顯子的H1047R。PI3K作為EGFR下游信號分子被激活，導致腫瘤細胞對EGFR-TKI等藥物的耐藥。所以，檢測PIK3CA基因突變可以預測腫瘤患者對EGFR-TKI等藥物的耐藥性。

（3）、目前的PIK3CA突變的檢測方法

目前PIK3CA突變的檢測方法有直接測序法，實時定量PCR法，液態芯片法等。其中，直接測序法的靈敏度低，要求受檢材料的突變比例大于20%，且檢測成本也較高；實時定量PCR法的靈敏度較直接測序法高，可達5%左右，但其通量低，且需面對其假陽性高的問題。液態芯片法的特異性和準確率高，但是需要針對突變位點設計探針和相應的微球，成本較高。

因此，我們需要找到一種靈敏度高，操作簡便，成本低的方法，以求可以實現對PIK3CA熱點突變快速簡便準確的檢測。

發明內容

為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種引物及該引物質譜檢測PIK3CA熱點突變的方法；旨在解決現有技術靈敏度低，通量低，準確度不高，成本高的問題。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：引物，包括擴增引物和測序引物，

所述的擴增引物序列如下：

SEQ?ID?NO:15’-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’

SEQ?ID?NO:25’-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’

SEQ?ID?NO:35’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’

SEQ?ID?NO:45’-ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’

SEQ?ID?NO:55’-ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC-3’

SEQ?ID?NO:65’-ACGTTGGATGTGTGACTCCATAGAAAATC-3’

SEQ?ID?NO:75’-ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG-3’

SEQ?ID?NO:85’-ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC-3’；

所述的延伸引物序列如下：