[發(fā)明專利]基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210573171.4
• 申請(qǐng)日: 2012-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN103103287A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 藍(lán)雨;王大燕;舒躍龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種rRT-PCR檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針、試劑盒及檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)

流感病毒基因組由8條（甲、乙型）或者7條（丙型）負(fù)鏈RNA節(jié)段構(gòu)成。根據(jù)病毒的核蛋白（NP）和基質(zhì)蛋白（M）不同分為甲型、乙型、丙型。丙型流感病毒廣泛分布于自然界，偶能引起局部地區(qū)和學(xué)校暴發(fā)。?

丙型流感病毒普遍感染健康人群，嬰兒出生時(shí)由母體帶來的抗體，在6個(gè)月時(shí)基本消失。從1歲起，個(gè)體血清陽性百分比逐漸增加，大約在20～30歲達(dá)到最高水平。根據(jù)日本調(diào)查，所有10歲兒童基本上都有丙型流感病毒抗體。?

丙型流感病毒跟A型流感病毒一樣，能引起嬰兒和老人流涕、發(fā)燒（腋下體溫≥38℃），出現(xiàn)感冒癥狀。中國(guó)曾于1981年和1982年由郭元吉教授在豬群中分離到2株丙型流感病毒，但中國(guó)到目前為止人群中沒有丙型流感病毒的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。日本對(duì)丙型病毒的監(jiān)測(cè)比較完善，通過RT-PCR檢測(cè)，人群感染丙型流感病毒的陽性率高達(dá)2.5％，可見丙型流感病毒的感染率并不比甲型和乙型的陽性率低。?

丙型流感病毒可以通過雞胚或者細(xì)胞分離，但分離率比較低，靈敏度不高。已有的普通RT-PCR檢測(cè)技術(shù)容易引起環(huán)境污染，檢測(cè)靈敏度低，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，不適于臨床標(biāo)本的快速檢測(cè)和鑒定。另外鑒定病毒還可以通過基因測(cè)序的方法，但耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，普通實(shí)驗(yàn)室難于完成。因此，目前尚無一種快速、靈敏的方法用于檢測(cè)丙型流感病毒及其變異株。?

上述現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下缺點(diǎn)：?

（1）操作費(fèi)時(shí)、成本高；?

（2）對(duì)實(shí)驗(yàn)室的軟硬件要求也比較高。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用方便的基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑克服現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)基因測(cè)序的方法，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高且對(duì)實(shí)驗(yàn)室軟硬件要求高的缺陷。?

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針，包括丙型流感病毒特異性引物和探針，?

所述丙型流感病毒特異性引物和探針包括丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針、丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針、丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針及丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針中的一種或任意幾種；?

所述丙型流感病毒特異性引物和探針針對(duì)流感病毒HE基因相對(duì)保守區(qū)域、丙型流感病毒NP基因相對(duì)保守區(qū)、針對(duì)丙型流感病毒MP基因相對(duì)保守區(qū)和/或針對(duì)丙型流感病毒NS基因相對(duì)保守區(qū)；?

所述丙型流感病毒特異性引物和探針是長(zhǎng)度為18～27bp的寡核苷酸片段；?

其中，針對(duì)HE基因和MP基因的探針與目的基因負(fù)鏈的堿基序列一致，針對(duì)NP基因和NS基因的探針與目的基因正鏈的堿基序列一致。?

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針，由于包括針對(duì)流感病毒HE基因相對(duì)保守區(qū)域；針對(duì)丙型流感病毒NP基因相對(duì)保守區(qū)、針對(duì)丙型流感病毒MP基因相對(duì)保守區(qū)所述丙型流感病毒NS基因和/或針對(duì)丙型流感病毒NS基因相對(duì)保守區(qū)引物和探針，可以通過rRT-PCR法檢測(cè)丙型流感病毒，操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用方便。?

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。?

進(jìn)一步，所述丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針為：?

正向引物（SEQ?ID?NO.1）：5'-YGGAGGAAATTTRTATGC-3'，?

反向引物（SEQ?ID?NO.2）：5'-GCCRATCCATGTACTTTG-3'，?

探針（SEQ?ID?NO.3）：5'-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3'；?

所述丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針為：?

正向引物（SEQ?ID?NO.4）：5'-RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3'，?

反向引物（SEQ?ID?NO.5）：5'-CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3'，?

探針（SEQ?ID?NO.6）：5'-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3'；?

丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針為：?

正向引物（SEQ?ID?NO.7）：5'-GACCACAATTATGCCTGAA-3'，?