[發(fā)明專利]基于多基因的丙型流感病毒實時熒光定量RT-PCR檢測試劑

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210573171.4
• 申請日: 2012-12-25
• 公開（公告）號: CN103103287A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 藍(lán)雨;王大燕;舒躍龍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

1.基于多基因的丙型流感病毒實時熒光定量RT-PCR檢測引物和探針，包括丙型流感病毒特異性引物和探針，其特征在于，

所述丙型流感病毒特異性引物和探針包括丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針、丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針、丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針及丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針中的一種或任意幾種；

所述丙型流感病毒特異性引物和探針針對流感病毒HE基因相對保守區(qū)域、丙型流感病毒NP基因相對保守區(qū)、針對丙型流感病毒MP基因相對保守區(qū)和/或針對丙型流感病毒NS基因相對保守區(qū)；

所述丙型流感病毒特異性引物和探針是長度為18～27bp的寡核苷酸片段；

其中，針對HE基因和MP基因的探針與目的基因負(fù)鏈的堿基序列一致，針對NP基因和NS基因的探針與目的基因正鏈的堿基序列一致。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于多基因的丙型流感病毒實時熒光定量RT-PCR檢測引物和探針，其特征在于，

所述丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針為：

正向引物（SEQ?ID?NO.1）：5'-YGGAGGAAATTTRTATGC-3'，

反向引物（SEQ?ID?NO.2）：5'-GCCRATCCATGTACTTTG-3'，

探針（SEQ?ID?NO.3）：5'-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3'；

所述丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針為：

正向引物（SEQ?ID?NO.4）：5'-RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3'，

反向引物（SEQ?ID?NO.5）：5'-CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3'，

探針（SEQ?ID?NO.6）：5'-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3'；

丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針為：

正向引物（SEQ?ID?NO.7）：5'-GACCACAATTATGCCTGAA-3'，

反向引物（SEQ?ID?NO.8）：5'-TGGTGAGTTGTCGGTTTC-3'，

探針（SEQ?ID?NO.9）：5'-FAM-TCTCCCAGGTCAAGTCTCTCCC-BHQ1-3'；

丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針為：

正向引物（SEQ?ID?NO.10）：5'-CGTAGAAATGAAGGGRAAG-3'，

反向引物（SEQ?ID?NO.11）：5'-CTCCACGATGATGATACA-3'，

探針（SEQ?ID?NO.12）：5'-FAM-CTCCAAGCAACATAGCACCAATT-BHQ1-3'。

3.基于多基因的丙型流感病毒實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包括檢測溶液，其特征在于，所述檢測溶液包括權(quán)利要求1或2所述的丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針、丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針、丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針及丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針中的一種或任意幾種。

4.基于多基因的丙型流感病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法，包括以下步驟：

（1）利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA，得到流感病毒RNA溶液；

（2）反應(yīng)體系：總體積25ul,取5ul步驟（1）制得的病毒RNA溶液，12.5ul2×RT-PCR?Buffer,1ul25×RT-PCR?Enzyme?Mix,加入針對丙型流感病毒HE基因和/或丙型流感病毒NP基因和/或丙型流感病毒MP基因和/或丙型流感病毒NS基因的檢測上游引物分別為0.5uL及下游引物分別為0.5uL，濃度均分別為40uM和探針0.5uL，濃度均分別為20uM，RNase?Free?H₂O加至25ul；

（3）步驟（2）反應(yīng)體系按下述條件進(jìn)行rRT-PCR檢測：

45℃/10min，1個循環(huán)，95℃/10min,1個循環(huán)，95°/15s,60°/45s，40個循環(huán)；每次循環(huán)的退火時收集熒光，檢測結(jié)果，根據(jù)擴增曲線和Ct判定結(jié)果。