[發(fā)明專利]糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210572924.X
• 申請日: 2012-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN103076214A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒炳德;鄒繼華;賈江花;林丹
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波美康生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N1/28
• 分類號(hào): G01N1/28;G01N33/96
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33228
• 代理人: 代忠炯

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體講是一種糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法。

背景技術(shù)

糖尿病是危及人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病晚期帶來的并發(fā)癥（如腎病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病等）具有致死性，已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管病變之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病，被醫(yī)學(xué)界稱為沉默的殺手，嚴(yán)重威脅著人類健康。

糖尿病治療關(guān)鍵是血糖水平的控制與穩(wěn)定，糖化血紅蛋白是血紅蛋白糖基化的產(chǎn)物，其能反映患者過去8～l2周的平均血糖水平，且不受短期血糖濃度波動(dòng)的影響，已被糖尿病控制和臨床實(shí)驗(yàn)協(xié)會(huì)（DCCT）推薦為血糖控制測試“金標(biāo)準(zhǔn)”。

糖化血紅蛋白的準(zhǔn)確測定需要一個(gè)穩(wěn)定質(zhì)控品來監(jiān)控儀器狀態(tài)及試劑的好壞。而由于糖化血紅蛋白存在易氧化及進(jìn)一步糖基化的缺陷，市場上現(xiàn)有的質(zhì)控品復(fù)溶后穩(wěn)定性差，人血用于作質(zhì)控品的原料來源有限且可能帶來HIV或者HPV等污染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服以上現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)：提供一種原料來源充足且穩(wěn)定性好的糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下：

一種糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法，它包括以下制備步驟：

1）先在反應(yīng)液中加入血紅蛋白，使每分升反應(yīng)液中血紅蛋白含量為1-40克，在15-45℃下糖基化反應(yīng)1-10天后，離心除去沉淀，留取上清夜，其中所述反應(yīng)液成分為：

緩沖液：20-200mM，pH?7.0-7.5

氯化鈉：9g/L

葡萄糖：50-200mM

還原劑：20-200mM

金屬螯合劑：0.1-10mM

防腐劑質(zhì)量百分含量：0.1-5%

其中上述溶劑為水；

2）將步驟1）中制備的上清液裝入透析袋，置于4℃透析液中透析至完全除去葡萄糖，離心取上清液，其中所述透析液成分為：

緩沖液：20-200mM，pH?7.0-7.5

氯化鈉：9g/L

還原劑：20-200mM

金屬螯合劑：0.1-10mM

防腐劑質(zhì)量百分含量：0.1-5%

其中上述溶劑為水；

3）將步驟2）中制備的上清液用血紅蛋白稀釋液稀釋至所需質(zhì)控品濃度，加入賦形劑，然后進(jìn)行低溫預(yù)凍、冷凍干燥，制成凍干粉，最后將凍干粉復(fù)溶、分裝即可使用；其中所述血紅蛋白稀釋液中的血紅蛋白濃度等于步驟1）中糖基化反應(yīng)前溶液中血紅蛋白濃度，且成分區(qū)別在于血紅蛋白稀釋液中不含葡萄糖。

所述血紅蛋白為重組人血紅蛋白。

所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、Good’s緩沖液中的一種。

所述還原劑為磷酸三（β-氯乙基)酯（TCEP）、二硫蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇、還原型谷胱甘肽、L-半胱氨酸、維生素C中的一種。

所述金屬螯合劑為乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）中的一種。

所述防腐劑為苯甲酸鈉、疊氮鈉、山梨酸鉀、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、proclin300中的一種。

所述賦形劑由凍干保護(hù)劑，填充劑，抗氧化劑，酸堿調(diào)整劑組成，其中各組分以它們加入溶液后的含量計(jì)為：凍干保護(hù)劑質(zhì)量百分含量0.5-10%，填充劑質(zhì)量百分含量0.5-15%，抗氧化劑摩爾濃度0.1-20mM，酸堿調(diào)整劑摩爾濃度0.05-20mM。所述凍干保護(hù)劑為甘油、二甲基亞砜（DMSO）、海藻糖、蔗糖、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）中的一種；所述填充劑為甘露醇、山梨醇、PEG4000、明膠中的一種；所述抗氧化劑為維生素D、維生素E、硫代硫酸鈉中的一種；所述酸堿調(diào)整劑為乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、甘氨酸、谷氨酸鈉中的一種。

所述低溫預(yù)凍為在-50℃至-90℃的條件下，預(yù)凍3小時(shí)以上將溶液冷凍成型。

所述冷凍干燥的條件為第一次干燥階段的升溫速度采用3-10℃每小時(shí)，持續(xù)20-35小時(shí)，第二次干燥階段的升溫速度采用20-25℃每小時(shí)，持續(xù)5-10h。

本發(fā)明的有益效果是：按本發(fā)明制備的糖化血紅蛋白質(zhì)控品，測值穩(wěn)定，能有效的監(jiān)控臨床檢驗(yàn)中試劑及儀器狀態(tài)；且相對(duì)于以往采用全血作為原料的方案，具有成本低、無污染、利于大批量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

下面用具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不僅局限于以下具體實(shí)施例。

實(shí)施例一