[發明專利]大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體及其構建和表達

在審

• 申請號: 201210571635.8
• 申請日: 2012-12-25
• 公開（公告）號: CN103898098A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 姚泉洪;田永生;彭日荷;許晶;王波;王麗娟;韓靜
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/113;C12N15/74;C12Q1/34
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵

技術領域

本發明屬生物工程技術領域，涉及一種大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體及其構建和表達，具體涉及一種根據梭菌密碼子偏愛化學合成的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體及其構建，以及將此表達載體在轉化入梭菌中能夠成功地看到大腸桿菌lacZ基因在梭菌中表達的應用。

背景技術

雖然近年來在梭菌的代謝工程已取得相當大的成績，但是幾個必須的遺傳工具的研究不佳限制了丙酮丁醇發酵的進一步發展，其中一個最重要的遺傳工具就是控制外源基因表達的報告基因。一個很好的報告基因可以幫助研究者詳細的研究溶劑梭菌中的不同的同源或者異源啟動子，從而可以進一步理解這些啟動子在梭菌中的調控功能。只有更好地理解啟動子的強度和調控功能才可以產生更加有效的梭菌表達載體，這樣的表達載體最終能夠被用作提高丙酮丁醇發酵的溶劑產量。在理解不同啟動子的強度和調控的前提下，結合反義RNA技術和基因敲除技術可以發展更加復雜的工程菌株來提高溶劑的產量。

由于目前并沒有有效的梭菌外源基因表達報告系統，所以目前就沒有詳細的梭菌啟動子的研究。而大腸桿菌基因在梭菌中表達的非常不理想，因而傳統的大腸桿菌野生型報告基因在梭菌中就不能很好的使用。對于另一個在其它許多菌株中使用非常良好的報告基因--綠色熒光蛋白，由于其需要足夠的氧來產生熒光的發色團，所以綠色熒光蛋白作為報告基因也不適合于梭菌。而非常適合作為梭菌報告基因的產氣莢膜梭菌氯霉素乙酰轉移酶則由于梭菌含有許多可能會干擾氯霉素乙酰轉移酶表達的高水平非特異性的乙酰輔酶A，因而應用前景也不是很理想。

發明內容

本發明所要解決的技術問題之一在于提供一種大腸桿菌lacZ基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。將其命名為EclacZS基因，它是通過梭菌偏愛密碼子生物法改造人工合成的。

本發明所要解決的技術問題之二在于提供一種梭菌OABC基因的啟動子，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。該啟動子是以R27320（5’-TCT,AGA,AAA,GGA,AAA,TAT,GAT,AAA,AAA,TTT,CA-3’)和R27321（5’-GGA,TCC,CAT,TAA,TAT,CGA,AAA,TAG,CTT,AAA,CCC,AAC-3’)為引物，以梭菌的基因組DNA（GenBank:AE001437.1）為模板，用日本TAKARA公司的高保真耐高溫DNA聚合酶Pyrobest經PCR擴增而得的。

本發明所要解決的技術問題之三在于提供一種包含上述梭菌OABC基因的啟動子的pYN7443質粒，它是在現有載體pSOS94的制備方法的基礎上通過把原有的ptb基因啟動子替換為上述梭菌OABC基因啟動子構建而成的，其中pSOS94制備方法參看U-B.Tummal?et?al.,1999,Applied?Ana?Environmental?Microbiology,9,3793–3799）。

本發明所要解決的技術問題之四在于提供一種大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體（pYN7443-EclacZS），它是在上述pYN7443質粒的BamHI和SacI酶切位點之間插入如上所述的EclacZS基因編碼的序列構建而成的。

本發明所要解決的技術問題之五在于提供一種所述大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體（pYN7443-EclacZS）的構建方法，具體包括以下步驟：

1）按照梭菌偏愛密碼合成生物法【Ai-Sheng?Xiong，Quan-hong?Yao，Ri-He?Peng，Xian?Li，Huiqin?Fan，Zong-ming?Cheng?and?Yi?Li，Nucleic?Acid?Research，2004，32(12)，e98:1～10】設計引物，引物均為5’端至3’端，進而合成大腸桿菌lacZ基因；

2）構建包含梭菌OABC基因的啟動子的pYN7443質粒；

3）利用BamHI和SacI進行雙酶切后，通過T4DNA連接酶將大腸桿菌lacZ基因即EclacZS序列與pYN7443質粒連接，進而得到大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體pYN7443-EclacZS。

將該大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體pYN7443-EclacZS轉化到梭菌中并測定大腸桿菌lacZ基因的活性，具體步驟如下：

1）參照Tardif等的電擊方法（C?Tardif?et?al.,2001,Journal?ofIndustrial?Microbiology?&Biotechnology,27,271-274）轉化梭菌。