[發明專利]一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法

有效

• 申請號: 201210568880.3
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN102978276A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 陳燕婷
• 申請（專利權）人: 陳燕婷
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/02;G01N21/33
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄧曉安

1.一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，方法步驟包括1）谷胱甘肽氧化還原酶基因的PCR克隆，2）谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌構建，3）谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌誘導表達，4）谷胱甘肽氧化還原酶酶液獲得，5）檢測樣品制備，6）反應催化體系構建，7）檢測，8）計算谷胱甘肽濃度，

所述谷胱甘肽氧化還原酶基因為序列表中的SEQ?ID1；

所述谷胱甘肽氧化還原酶基因的PCR克隆為設計PCR引物1和引物2，利用PCR技術對序列SEQ?ID1進行克隆，引物1：5'GCGGGATCCATGACTAAACACTATG3'，引物2：

5'GCGAAGCTTTTAACGCATTGTCACGA3'；

所述反應催化體系構建為反應體系包括：谷胱甘肽氧化還原酶酶液1、含磷酸的緩沖溶液2、樣品3；

所述檢測為采用紫外可見分光光度計檢測反應催化體系在340nm處的吸收值A的變化。

2.根據權利要求1所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化還原酶基因的PCR克隆為設計谷胱甘肽氧化還原酶基因GOR的引物，利用PCR技術克隆并回收得到谷胱甘肽氧化還原酶基因，設計的引物1為：5'GCGGGATCCATGACTAAACACTATG3'，引物1酶切位點為BamHⅠ，設計的引物2為：5'GCGAAGCTTTTAACGCATTGTCACGA3'，引物2酶切位點為HindⅢ，以大腸桿菌DH5α基因組為模版，PCR擴增工藝條件為：94°C預變性5min，94°C30s，56°C1min，72°C1min,擴增25～30個循環，最終延伸反應為72°C10min。

3.根據權利要求1或2所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌構建為：獲得的谷胱甘肽氧化還原酶基因GOR和表達載體pET28α進行連接構建，得到重組表達質粒pET28α-GOR，選取大腸桿菌為表達宿主，將重組表達質粒pET28α-GOR導入宿主中，得到谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌。

4.根據權利要求3所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌誘導表達為將構建得到的谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌進行培養2~3h，利用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG對培養了2~3h的谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌菌液進行誘導，繼續培養10~14h，誘導表達完成。

5.根據權利要求3所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽氧化還原酶酶液獲得為離心收集完成誘導表達的谷胱甘肽氧化還原酶重組表達菌菌體，利用濃度為20mM，pH為7.4的磷酸緩沖液對菌體進行清洗2~3次，并將菌體重懸于濃度為20mM，pH為7.4的磷酸緩沖液中獲得菌體重懸液，菌體和磷酸緩沖液的體積比為1:30~50，利用超聲破碎對菌體重懸液進行破碎，超聲破碎條件為工作時間3s，間歇時間2s，功率80W，次數200，超聲破碎后離心收集上清，獲得谷胱甘肽氧化還原酶酶液。

6.根據權利要求3所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述反應催化體系構建為按順序先后將谷胱甘肽氧化還原酶酶液1、含磷酸的緩沖溶液2、樣品3加入到反應皿中，谷胱甘肽氧化還原酶酶液1、緩沖溶液2、樣品3的體積比為300ul：2600ul：100ul，緩沖溶液2的成分為20mM的K₂HPO₄溶液，得到反應催化體系。

7.根據權利要求4~6任一項所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述檢測樣品制備為采用組織破碎儀將需要檢測的樣品細胞進行組織破碎，細胞樣品、直徑為0.2um的磁性、磷酸緩沖液按體積比1:3~5：25~50的比例混合得到，混合液破碎條件為，破碎時間為5~8min，破碎功率為200W，破碎完后離心收集上清得到檢測樣品。

8.根據權利要求7所述的一種快速檢測細胞中谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述檢測為將構建好的反應催化體系放入紫外可見分光光度計檢測槽中，設置檢測檢測時間為2~3min，波長為340nm，利用移液槍將NADP⁺/NAD⁺⁴溶液加入反應催化體系中，并用移液槍吹打反應體系2~3次，啟動紫外可見分光光度計檢測功能，得到反應催化體系在340nm處的吸收值A變化曲線。