[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)1,3-丙二醇的菌株篩選方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210568673.8
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN102965323A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方柏山;陳斌;朱春杰;王世珍
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12P7/18;C12R1/145
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務(wù)所 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

1.一種菌種，所述菌種為丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160，該菌種已于2012年07月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.6317，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101。

2.如權(quán)利要求1所述的丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160的篩選方法，其特征在于其具體步驟為：

取采集樣品各1g，加入到9mL白菜汁中，37℃密封富集培養(yǎng)24h后置80℃水浴10min，殺死非芽孢菌，轉(zhuǎn)入梭菌增殖液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24h再置80℃水浴10min，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃厭氧選擇性富集培養(yǎng)24h后進行高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能夠生產(chǎn)1,3-丙二醇的陽性菌；再采用高層瓊脂柱法，分離出單菌落；同時進行好氧和厭氧培養(yǎng)，除去兼性厭氧菌，得到嚴格厭氧菌，分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能夠生產(chǎn)1,3-丙二醇和培養(yǎng)特征、菌落形態(tài)均符合丁酸梭菌培養(yǎng)特征的菌株進行16S?rDNA序列分析鑒定。

3.如權(quán)利要求2所述的丁酸梭菌（Ciostridium?butyricum）Gen160的篩選方法，其特征在于所述梭菌增殖液體培養(yǎng)基為：胰蛋白胨，10g/L；牛肉膏，10g/L；酵母粉，3g/L；葡萄糖，5g/L；NaCl，3g/L；NaAc，3g/L；可溶性淀粉，1g/L；半胱氨酸鹽酸鹽，0.5g/L；pH?7.5。

4.如權(quán)利要求2所述的丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160的篩選方法，其特征在于所述高層瓊脂柱培養(yǎng)法的具體步驟為：加熱融化10管加入Vc的RCM固體培養(yǎng)基，每管9mL培養(yǎng)基，待冷至80℃，在第1管中接入1mL菌液，充分振蕩均勻后，迅速將其1mL培養(yǎng)基倒入第2管，充分振蕩均勻后將其1mL培養(yǎng)基倒入第3管，依次稀釋至第10管，將試管放入冰中，迅速冷卻，待瓊脂凝固，每管加入2.5mL滅菌的液體石蠟，置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑選單菌落于無菌水中，振蕩混勻，用無菌注射器分別轉(zhuǎn)入RCM液體培養(yǎng)基血清瓶中，37℃、150rpm搖床培養(yǎng)36h。

5.如權(quán)利要求1所述的丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160的改造方法，其特征在于其具體步驟為：

將丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160接入含有甘油的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～20h，然后以4%～10%的接種量接種于含廢甘油濃度50g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基的血清瓶中進行搖瓶厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為31～39℃，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入7～15g/L碳酸鈣以維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)12～24h后，以4%～10%的接種量接種于另一瓶同樣培養(yǎng)基成分的血清瓶中，如此循環(huán)20次，將菌種保存于生長培養(yǎng)基中并于4℃冰箱保存，得到丁酸梭菌第20代菌株，記作Gen20；依次提高廢甘油濃度70、80、90、100g/L，分別采用上述步驟進行不斷傳代培養(yǎng)，每種條件培養(yǎng)20代，分別記為Gen40、60、80、100；在Gen100基礎(chǔ)上，依次提高抑制菌體生長的副產(chǎn)物丁酸濃度15、20、25g/L，分別采用上述步驟進行不斷傳代培養(yǎng)，每種條件培養(yǎng)20代，分別記為Gen120、140、160；分別在分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵條件下對比保存菌株，擇優(yōu)進行單菌落的分離，利用高層瓊脂柱法挑選出純菌株。

6.如權(quán)利要求5所述的丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160的改造方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基為：甘油，20g/L；K₂HPO₄·3H₂O，4.45g/L；KH₂PO₄，1.3g/L；(NH₄)₂SO₄，2g/L；MgSO₄·7H₂O，0.2g/L；CaCl₂·2H₂O，0.02g/L；酵母粉，1g/L；微量元素溶液，1mL；Fe溶液，1mL；自然pH。