[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)1,3-丙二醇的菌株篩選方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210568673.8
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN102965323A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方柏山;陳斌;朱春杰;王世珍
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12P7/18;C12R1/145
• 代理公司: 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及1,3-丙二醇，尤其是涉及一種生產(chǎn)1,3-丙二醇的菌株篩選方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

1,3-丙二醇是一種重要的化工原料，它可直接作為抗凍劑、多種增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑的合成原料，也可用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)。其最主要的用途是作為合成聚酯、聚醚和聚氨酯等高分子材料的單體。目前，1,3-丙二醇的合成方法主要有兩種，即化學(xué)法和生物法。其中化學(xué)法生產(chǎn)1,3-丙二醇已日趨成熟，但化學(xué)法消耗了不可再生的有限資源，并造成了環(huán)境污染。近年來，生物轉(zhuǎn)化法以其利用可再生資源、對環(huán)境友好等特點日益受到人們的重視。隨著石化資源的日益枯竭，生物法必將取代化學(xué)法。

21世紀(jì)，石油供需矛盾日益尖銳，石油化工及石化燃料燃燒造成的環(huán)境問題日益突出，開發(fā)新的對環(huán)境無害的可再生能源日益得到各國的重視。生物柴油是一種環(huán)境友好的生物燃料，在使用中可部分或全部替代石化柴油。近年來，生物柴油產(chǎn)業(yè)異軍突起，飛速發(fā)展，而廢甘油是生物柴油生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物，每生產(chǎn)1噸生物柴油會副產(chǎn)0.1噸廢甘油。隨著世界范圍內(nèi)生物柴油需求量和生產(chǎn)量的迅猛增長，廢甘油成為豐富而廉價的原料，對它的有效利用也成為緊迫的課題。

目前以甘油為原料制備1,3-丙二醇主要有兩種方法：

1.中國專利200710113923.8公開了一種采用化學(xué)法轉(zhuǎn)化甘油制備1,3-丙二醇的方法，采用兩步反應(yīng)，第一步是1,3-溴氯丙烷與乙酸鈉在醇類催化劑的作用下生成1,3-丙二乙酯，第二步是上步反應(yīng)得到的雙脂與甲醇在樹脂類催化劑的作用下生成1,3-丙二醇。

2.中國專利200710048122.8公開了一種采用微生物發(fā)酵甘油制備1,3-丙二醇的方法，該方法所使用的菌種為克雷伯氏桿菌，為條件致病菌，存在生物安全性方面的隱患。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160。

本發(fā)明的第二目的在于提供丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160的篩選方法。

本發(fā)明的第三目的在于提供丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160的改造方法。

本發(fā)明的第四目的在于提供丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160在利用廢甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇中的應(yīng)用。

所述丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160，是一種益生菌，該菌種已于2012年07月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.6317，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101。

所述丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160從土壤樣品中篩選得到，具體步驟為：

取采集樣品各1g，加入到9mL白菜汁中，37℃密封富集培養(yǎng)24h后置80℃水浴10min，殺死非芽孢菌，轉(zhuǎn)入梭菌增殖液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24h再置80℃水浴10min，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃厭氧選擇性富集培養(yǎng)24h后進(jìn)行高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能夠生產(chǎn)1,3-丙二醇的陽性菌；再采用高層瓊脂柱法，分離出單菌落；同時進(jìn)行好氧和厭氧培養(yǎng)，除去兼性厭氧菌，得到嚴(yán)格厭氧菌，分析發(fā)酵產(chǎn)物，選取能夠生產(chǎn)1,3-丙二醇和培養(yǎng)特征、菌落形態(tài)均符合丁酸梭菌培養(yǎng)特征的菌株進(jìn)行16S?rDNA序列分析鑒定。

所述梭菌增殖液體培養(yǎng)基即生長培養(yǎng)基（RCM培養(yǎng)基）為：胰蛋白胨，10g/L；牛肉膏，10g/L；酵母粉，3g/L；葡萄糖，5g/L；NaCl，3g/L；NaAc，3g/L；可溶性淀粉，1g/L；半胱氨酸鹽酸鹽，0.5g/L；pH?7.5。

所述高層瓊脂柱培養(yǎng)法的具體步驟為：加熱融化10管加入Vc的RCM固體培養(yǎng)基（每管9mL培養(yǎng)基），待冷至80℃左右，在第1管中接入1mL菌液，充分振蕩均勻后，迅速將其1mL培養(yǎng)基倒入第2管，充分振蕩均勻后將其1mL培養(yǎng)基倒入第3管，依次稀釋至第10管。將試管放入冰中，迅速冷卻。待瓊脂凝固，每管加入2.5mL滅菌的液體石蠟，置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。用接種環(huán)挑選單菌落于無菌水中，振蕩混勻，用無菌注射器分別轉(zhuǎn)入RCM液體培養(yǎng)基血清瓶中，37℃、150rpm搖床培養(yǎng)36h。

所述丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160的改造方法的具體步驟為：