[發明專利]具有FRET效應的還原敏感型熒光納米膠束及其制備方法

有效

• 申請號: 201210568269.0
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN103102479A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 蔡林濤;石碧華;劉朋;龔萍;王碧
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C08G63/91
• 分類號: C08G63/91;C08G63/664;C08J3/09;C08J3/07;C08L67/04;C09K11/06;A61K47/34;A61K49/00;A61K9/107
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 劉誠;吳平

技術領域

本發明涉及基因及藥物載體領域，特別是涉及一種具有FRET效應的還原敏感型熒光納米膠束及其制備方法。

背景技術

熒光共振能量轉移（Fluorescence?Resonance?Energy?Transfer,FRET）技術作為一種經典的熒光技術，與熒光成像技術結合，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸檢測等方面具有廣泛的應用。FRET是指在兩個不同的熒光基團中，當作為供體的熒光基團與作為受體的熒光基團的吸收光譜有一定重疊，并且這兩個熒光基團的距離在1~10納米時，熒光能量由供體分子向受體分子轉移。使得供體分子的熒光強度比它單獨存在時要低的多，而受體分子發射的熒光卻大大增強。

近年來，具有環境響應性的智能型自組裝形成的聚合物膠束作為藥物載體在生物醫學領域顯示了良好的應用前景，引起了越來越多科學工作者的關注。智能型聚合物納米膠束利用某些鏈段對環境的敏感性，在相應條件下使其發生降解、聚合物結構的相轉變或體積相轉變等，從而達到控制藥物釋放的目的。目前，已合成了多種基于一種或多種環境響應型的智能化的聚合物納米膠束，如Jun?Chen等合成了一種pH值和還原敏感雙重響應的聚合物，用于細胞內的阿霉素運輸，有效地增強了阿霉素在細胞內的釋放。

但是，同時具有FRET效應和還原敏感響應的熒光納米膠束一直未見報道。

發明內容

基于此，有必要提供一種同時具有FRET效應和還原敏感響應的熒光納米膠束及其制備方法。

一種具有FRET效應的還原敏感型熒光納米膠束的制備方法，包括：

制備聚乙二醇-聚己內酯（mPEG-PCL）；

將mPEG-PCL溶于四氫呋喃（THF）中，加入三乙胺(TEA)并攪拌，再加入對硝基苯氯甲酸酯(4-nitrophenyl?chlorformate,PNC)，室溫攪拌反應過夜，經純化處理得到mPEG-PCL-PNC；

將胱胺二鹽酸鹽(cystamine?dihydrochlochloride)溶于二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)和吡啶的混合液中，室溫攪拌4小時，將所述mPEG-PCL-PNC溶于二甲基亞砜，混合所述胱胺二鹽酸鹽和mPEG-PCL-PNC的溶液，并于35~50℃下連續攪拌反應2~3天，在重蒸水中透析3~4天，收集透析產物，冷凍真空干燥后得到mPEG-PCL-s-s-NH₂；

將所述mPEG-PCL-s-s-NH₂溶于二甲基甲酰胺中，加入異硫氰酸熒光素(Fluorescein?Isothiocyanate,FITC)，所述mPEG-PCL-s-s-NH₂與FITC的摩爾比為1:1~1:5，常溫下攪拌，反應過夜，在二甲基甲酰胺中透析1~2天，轉移至重蒸水中繼續透析2~3天，真空冷凍干燥得到mPEG-PCL-s-s-FITC；

將所述mPEG-PCL-s-s-NH₂溶于二甲基甲酰胺中，加入改性4-二甲胺偶氮苯-4′-羧酸(Dabcyl)，所述mPEG-PCL-s-s-NH₂與所述改性Dabcyl的摩爾比為1:1~1:5，常溫下攪拌，反應過夜，在二甲基甲酰胺中透析1~2天，轉移至重蒸水中繼續透析2~3天，真空冷凍干燥得到mPEG-PCL-s-s-Dabcyl；

將所述mPEG-PCL-s-s-FITC和mPEG-PCL-s-s-Dabcyl分別溶于四氫呋喃中，然后按照所述mPEG-PCL-s-s-FITC與mPEG-PCL-s-s-Dabcy的質量比為1:1~1:3的比例混合得到混合溶液，在攪拌的過程中滴加重蒸水，將滴加了重蒸水的混合溶液轉移到重蒸水中透析2~3天，得到具有FRET效應的還原敏感型聚合物納米膠束。

在其中一個實施例中，所述改性Dabcyl通過以下步驟制備：將Dabcyl溶于二甲基甲酰胺中，依次加入體積為所述二甲基甲酰胺的5~10倍量的二環己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，常溫下攪拌反應過夜，離心取上清，得到改性Dabcyl。

在其中一個實施例中，所述制備mPEG-PCL包括步驟：

將用氫化鈣干燥，減壓蒸餾；取甲基化的聚乙二醇（mPEG），于80℃抽真空1小時；往所述甲基化的聚乙二醇中加入辛酸亞錫和干燥的在氮氣保護下140℃反應8小時后，加入氯仿溶解反應產物，再用正己烷沉淀，抽濾，真空干燥后得到mPEG-PCL。

在其中一個實施例中，所述mPEG-PCL與所述三乙胺的摩爾比為300:1~100:1。