[發明專利]P16免疫細胞化學試劑盒及其制備用多肽序列

有效

• 申請號: 201210567622.3
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN103076453A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 狄文;何以豐;張梅瑩
• 申請（專利權）人: 何以豐;狄文
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C07K7/08;C07K14/47
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 王敏杰

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，涉及一種用于標記人類細胞中P16蛋白的免疫細胞化學試劑盒制備方法和用于制備試劑盒中相關單克隆抗體的幾種多肽成分。

背景技術

人類P16蛋白是細胞中的一種保護性蛋白，能夠防止人體細胞癌變，起到阻止細胞過度增殖的作用。人類P16蛋白的編碼基因為CDKN2A，位于9號染色體短臂上。P16蛋白能夠與周期素依賴性激酶4結合并抑制其活性，使細胞停留于G1期，無法持續增殖。故而，P16是一種抑癌蛋白。細胞中，P16蛋白的表達通常受到另兩種抑癌蛋白：P53和RB的調控，處于低水平狀態。

宮頸癌及其癌前期細胞中，P16蛋白表達量常會異常增加，其原因在于當宮頸細胞處于癌變早期時，抑癌蛋白P53和RB的功能常常處于缺失狀態，因此P16蛋白的合成表達被從抑制狀態中釋放了出來。不過，此時細胞中雖有P16蛋白過量表達，因無法抵抗P53和RB功能缺失帶來的不利作用，仍將進入持續增殖狀態，進而轉變為癌細胞。故而，我們如在宮頸癌前期細胞中考察P16蛋白表達量，就可以預測這些細胞的轉歸命運。目前，已經知道，宮頸癌Hela細胞株P16蛋白表達量明顯高于正常水平，是典型的P16陽性細胞株。

在胃癌、肺癌等惡性腫瘤中，部分癌細胞可因其P16蛋白編碼基因的外顯子突變或啟動子甲基化的關系，P16蛋白表達量顯著降低。研究表明，較之周圍P16蛋白表達水平較高的同類型癌細胞而言，這些P16蛋白表達量較低的癌細胞的惡性程度通常更高。因此，如在惡性胸水或腹水檢測到這類P16表達為陰性的胃癌或肺癌細胞，說明患者預后較差。

免疫細胞化學是指利用針對某種蛋白的特異性抗體對細胞中該蛋白表達情況進行檢測的一種實驗方法。通常分為三步：（1）以第一抗體（主要使用單克隆抗體，比如小鼠抗人P16單克隆抗體）識別細胞中的目標蛋白，（2）以帶有酶分子標記的第二抗體（主要使用多克隆抗體，比如：兔抗小鼠IgG多克隆抗體），識別第一抗體，（3）以酶分子底物（如：辣根過氧化物酶底物為二氨基聯苯胺）使被標記目標蛋白顯色。免疫細胞化學技術被廣泛應用于生命科學和醫療實踐工作中，用以判斷未知細胞的組織學來源、病理學性質和分子生物學特征。

免疫細胞化學中所用的單克隆抗體（即：第一抗體）來自于單抗制備技術。這種技術誕生于1975年，當時Kohler和Milstein兩人發現將小鼠骨髓瘤細胞與和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交瘤細胞既可產生抗體，又可無限增殖，從而創立了單克隆抗體雜交瘤技術。目前，單克隆抗體的雜交瘤制備技術廣泛用于抗體的工業化生產中。其生產流程主要是先采用某種特定的抗原，比如：蛋白類抗原，注射入小鼠皮下，待免疫過程完成后，收集對該抗原具有反應性的脾細胞（實際是分泌單克隆抗體的B細胞），然后將其與骨髓瘤細胞融合，篩選出對免疫原（或抗原表位）最具反應性的雜交瘤克隆，進行大規模擴增，再從擴增瘤細胞所用的培養基中分離純化出目標抗體即可。單抗制備技術獲得的抗體多為IgG抗體，它們可在體外條件下對抗原成分中的特定表位進行免疫識別和結合。需要注意的是，免疫動物所用的抗原物質應有足夠大的分子量，如果所用抗原物質分子量過小，則有可能因為無法刺激B細胞增殖而不能獲得所需的單克隆抗體。為此，通常建議采用完整的蛋白分子對小鼠進行免疫。但也有時候，為了制備針對蛋白分子中某個抗原表位的單克隆抗體，有考慮采用蛋白分子的部分肽段來進行抗體制備的做法。此時，如免疫動物所用肽段分子量過小，例如：只含10-20個氨基酸時，必須將此肽段先偶聯到一個分子量較大的載體蛋白上，然后以偶聯物免疫動物，再通過酶聯免疫吸附檢測法篩選出對該肽段有較高反應性的雜交瘤克隆，最后對這些瘤細胞加以大量擴增，即可得到針對某特定抗原表位的單克隆抗體產物。

免疫反應機制上，抗原和抗體的識別和結合是特異性的，需要雙方分子之間具備相互契合的空間結構，就如同是鎖和鑰匙之間的一一對應關系那樣。但是，抗原抗體的結合過程中，兩者的空間構象并不是一成不變的，相反，這是一個相互誘導的過程。通常來說，抗原分子的出現可以誘導抗體分子產生折角和彎曲，以利于抗原分子進入結合位點，實現兩者更為密切的結合。而抗體分子在識別抗原表位過程中也可以打開抗原分子表面的屏障，深入到后者內部的識別區位中，更好地與抗原結合。利用抗原抗體分子在識別過程中的這些構象改變機制，現已能夠人為設計出一些特殊的抗體分子，通過誘導抗原分子發生各種預定的構象乃至于一些化學鍵的改變，用以實現某些特定的生物學或化學目標。比如：抗體酶。