[發明專利]一種制備丙氨酸轉氨酶的方法及應用

無效

• 申請號: 201210567473.0
• 申請日: 2012-12-25
• 公開（公告）號: CN103014033A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 肖飛;黃薇;張傳寶;王大光
• 申請（專利權）人: 肖飛
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/70;C12N9/10;C07K16/40;G01N33/53
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技術領域

本發明屬于基因工程和蛋白表達領域，涉及一種用生物工程技術高效制備丙氨酸轉氨酶的方法，產物可作為抗原物質進行動物免疫，篩選相關抗體，同時為臨床化學診斷所需校準品、標準物質和參考品的制備開發奠定基礎。

背景技術

丙氨酸轉氨酶(alanine?aminotransferase，ALT，EC2.6.1.2)是谷氨酸和丙酮酸之間的轉氨酶，又名谷丙轉氨酶，簡稱GPT、ALT。谷丙轉氨酶升高在臨床是很常見的現象。肝臟是人體最大的解毒器官，該臟器是不是正常，對人體來說是非常重要的。GPT升高是肝臟功能出現問題的一個重要指標。在常見的因素里，各類肝炎都可以引起GPT升高，這是由于肝臟受到破壞所造成的。一些藥物如抗腫瘤藥、抗結核藥，都會引起肝臟功能損害。大量喝酒、食用某些食物也會引起肝功能短時間損害。

GPT主要存在于肝細胞漿內，其細胞內濃度高于血清中1000-3000倍。只要有1％的肝細胞壞死，就可以使血清酶增高一倍。

臨床上有很多疾病可引起轉氨酶異常：

1.病毒性肝炎這是引起轉氨酶增高最常見的疾病，各類急、慢性病毒性肝炎均可導致轉氨酶升高。

2.中毒性肝炎多種藥物和化學制劑都能引起轉氨酶升高，但停藥后，轉氨酶可恢復正常。

3.大量或長期飲酒者谷丙轉氨酶也會升高。

4.肝硬化與肝癌肝硬化活動時，轉氨酶都高于正常水平，應該積極治療。

5.膽道疾病膽囊炎、膽石癥急性發作時，常有發熱、腹痛、惡心、嘔吐、黃疸、血膽紅素及轉氨酶升高

6.心臟疾病急性心肌梗塞、心肌炎、心力衰竭時，谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶均升高，患者常有胸痛、心悸、氣短、浮腫。心臟檢查有陽性體征及心電圖異常。

7.其他某些感染性疾病，如肺炎、傷寒、結核病、傳染性單核細胞增多癥等，都有轉氨酶升高的現象。

因此，GPT被世界衛生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標。谷丙轉氨酶的正常參考值為0～40U/L。

我國幅員遼闊，人口眾多，臨床診斷試劑市場巨大，前景廣闊。就國內的現狀來說，我國的診斷試劑行業仍處于成長初期，即產品研發與生產的投入初期，成長期還沒有真正到來，而我國診斷試劑市場規模約為全球市場的1/14，有較大的成長空間。研制價廉物美的診斷試劑產品無疑是非常必要且具重要意義的。

目前國外的產品通常是把試劑、參考品(校準品、質控品)、儀器作為一個系統(封閉系統)推入市場，在檢測重復性、準確性上有很大的優勢，并且具有市場壟斷性。國內主要的診斷試劑生產廠家幾乎都沒有生產相應質控品的經驗和實力，市場上認可的國產產品寥寥無幾。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種操作簡單、制備成本低廉，成功率高的制備丙氨酸轉氨酶的方法。

1.為實現上述目的，本發明一種制備丙氨酸轉氨酶的方法，該方法包括：

1)改造并全基因合成人源化丙氨酸轉氨酶編碼基因序列，去除大腸桿菌稀有密碼子；

2)將步驟1)中改造后的丙氨酸轉氨酶編碼基因序列插入表達載體中，并用大腸桿菌菌株轉化表達；

3)將轉化表達菌株接種于LB培養基，IPTG誘導；

4)所得菌體破菌，離心分離，過Ni-NTA柱純化；

其中，步驟1)中改造后的全基因合成人源化丙氨酸轉氨酶編碼基因序列為：

ATGGCTTCTT?CTACTGGTGA?TCGTTCTCAG?GCTGTTCGTC?ATGGTCTGCG?TGCGAAAGTT

CTGACCCTGG?ACGGCATGAA?CCCGCGTGTT?CGTCGCGTCG?AATACGCCGT?GCGTGGCCCG

ATCGTTCAGC?GTGCTCTGGA?ACTGGAACAA?GAACTGCGTC?AGGGCGTTAA?AAAGCCGTTC

ACCGAGGTTA?TCCGCGCCAA?CATCGGCGAT?GCCCAGGCTA?TGGGTCAGCG?TCCTATCACC

TTCCTGCGCC?AGGTCCTGGC?GCTGTGCGTA?AACCCAGACC?TGCTGAGCTC?TCCGAACTTC

CCGGACGACG?CTAAGAAACG?TGCGGAACGC?ATCCTGCAGG?CATGCGGTGG?CCACAGCCTG