[發(fā)明專利]核酸等溫擴增系列新方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210566754.4
• 申請日: 2012-12-25
• 公開（公告）號: CN103834720A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曲海濤;王德國;張文超
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱德歌生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
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技術(shù)領(lǐng)域

本創(chuàng)新發(fā)明涉及全新的核酸等溫擴增法，主要是創(chuàng)造了引物設(shè)計的新結(jié)構(gòu)，可用于各種基因的檢測領(lǐng)域，此方法不僅可以應(yīng)用于（DNA、RNA）定性、定量檢測，還可以應(yīng)用于一管式檢測基因突變等。?

背景技術(shù)

一直以來，病原微生物的體外培養(yǎng)是病原體診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。據(jù)微生物學(xué)家的估計，采用目前的培養(yǎng)技術(shù)，僅有約1%的細(xì)菌可以培養(yǎng)。在過去的一個世紀(jì)里，以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）為代表的基于核酸的檢測技術(shù)發(fā)展迅速，為其他病原體的精確檢測診斷提供了可能。毋庸置疑，Kary?Mtlllis發(fā)明的PCR技術(shù)是20世紀(jì)80年代分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項革命性突破。也許他本人當(dāng)時也沒有想到，PCR技術(shù)會在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮如此重要的作用。經(jīng)過幾十年的改進(jìn)，PCR方法已從定性發(fā)展為定量，能夠在幾個小時內(nèi)，從幾個拷貝或單個細(xì)胞開始擴增到數(shù)十億特異性的核酸片段，而且特異性也有了極大的提高。然而，從PCR技術(shù)的誕生之日起，它始終無法擺脫依賴精良儀器設(shè)備的局限，使得以PCR為基礎(chǔ)的核酸擴增檢測技術(shù)無法更廣泛地推廣和應(yīng)用。?

基于這種強烈的需求，以核酸等溫擴增技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)近年來得到了迅猛的發(fā)展。多種機制的等溫技術(shù)不僅誕生，而且有些技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，完成了從實驗室到實際應(yīng)用的過渡，正逐步在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛運用。特別是在臨床和現(xiàn)場（point－of－care）快速診斷技術(shù)方面，核酸等溫擴增技術(shù)顯示了其突出的優(yōu)越性。更為重要的是，核酸等溫擴增技術(shù)由于不需要溫度變化的時間過程且擺脫了對精良儀器設(shè)備的依賴，使得我們對病原體的檢測診斷得以快速并高通量的實現(xiàn)。?

現(xiàn)有最主要的等溫擴增技術(shù)就是環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（可參見其相關(guān)專利ZL?00818262.0，ZL01810370.7，ZL01812204.3，ZL02815992.6，ZL200610080379.7），它效率較高，但是在缺少一個內(nèi)引物或外引物的情況下還可以發(fā)生擴增反應(yīng)，因此不可以用做耐藥檢測基因突變領(lǐng)域。?

本發(fā)明開創(chuàng)了核酸等溫擴增的全新時代，為等溫擴增找到了全新的可推導(dǎo)下去的反應(yīng)機理，使核酸檢測應(yīng)用領(lǐng)域更加廣泛，同時其中的個別結(jié)構(gòu)也解決了檢測基因突變的問題。?

發(fā)明內(nèi)容

全新的核酸擴增反應(yīng)引物設(shè)計結(jié)構(gòu)，也可以稱為核酸的合成結(jié)構(gòu)。具體內(nèi)容如下：??

1.核酸擴增引物設(shè)計核心結(jié)構(gòu)及原理

DNA雙鏈（見圖1）

核酸擴增引物設(shè)計核心結(jié)構(gòu)（見圖2），結(jié)構(gòu)中F₀引物是變值，但不能引起二聚體的任何一定長度的引物片段，每個F₀均是獨立的，兩個F₀可以取不同值。???先通過其中一條引物擴增反應(yīng)過程分析如下：

引物F0-A擴增反應(yīng)（見圖3）；???????

引物F₀-B再擴增反應(yīng)（見圖4）；????

引物F₀-B擴增反應(yīng)后(見圖5)；???????????????????????????

引物F₀-A再擴增反應(yīng)(見圖6)；

最終形成如下雙鏈(見圖7)；

所設(shè)計引物可以分別從兩端擴增反應(yīng)(見圖8)。

在擴增反應(yīng)的過程中不斷形成如圖7的雙鏈，1個變2個，2個變4個，持續(xù)反應(yīng)下去。?以上就是我們核酸擴增的反應(yīng)核心結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機理。從以上的反應(yīng)過程和機理完全可以確認(rèn)兩個F₀是可以取不同值的，核心反應(yīng)機理依然成立。?

該核心反應(yīng)是形成為引物后續(xù)持續(xù)反應(yīng)的雙鏈，為加快形成雙鏈，最好拉近對向引物的距離，也就是優(yōu)先形成雙鏈以避免引物形成二聚體時雙鏈尚未形成。?