[發明專利]一種豆狀帶絳蟲18kDa抗原的制備方法及其應用

無效

• 申請號: 201210566303.0
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN103074344A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 楊光友;楊德英;彭雪蓉;古小彬
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種豆狀帶絳蟲18?kDa抗原的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟：

步驟一，激活豆狀帶絳蟲六鉤蚴，并進行總RNA提取；

步驟二，以總RNA為模板，合成cDNA；

步驟三，擴增Tp18編碼區，并進行Tp18基因的生物信息學分析；

步驟四，對Tp18進行原核表達，并純化表達蛋白。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟一，激活豆狀帶絳蟲六鉤蚴，并進行總RNA提取的實現方法為：

從自然感染的家兔體內采集新鮮的豆狀囊尾蚴感染犬，五周后收集節片并用PBS緩沖液洗凈后保存于4℃的保存液；

將收集到的200個節片先用PBS緩沖液沖數次，在1.5?mL的離心管中剪碎，1%的胃蛋白酶液37℃孵育1?h，3000?r/min離心5?min收集蟲卵，并PBS緩沖液漂洗三次；

用1%的次氯酸鈉溶液孵化蟲卵，在顯微鏡下觀察到卵殼破殼率達90%時，立即加入等量的0.2?M/L的硫代硫酸鈉終止反應，3000?r/min離心5min后用PBS緩沖液漂洗三次；

加入含胰酶和兔膽汁的孵化激活液于37℃孵育45min，3000?r/min離心5min后棄上清，PBS緩沖液漂洗三次，利用0.4%的臺盼藍檢查激活六鉤蚴的活力；

激活后的六鉤蚴活力達70%以上時，使用Trizol試劑進行總RNA的提取。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，保存液中包含100?IU/mL青霉素、0.l?mg/mL鏈霉素及0.25?mg/mL兩性霉素B。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟二，以總RNA為模板，合成cDNA的實現方法為：

根據測序完成的豆狀帶絳蟲轉錄組數據，以總RNA為模板，利用SuperScriptTM?II?Reverse?Transcriptase，結合5’末端通用接頭引物smartTMⅢ和3’末端通用接頭引物BRL-A1進行逆轉錄PCR（RT-PCR）以合成cDNA的第一條鏈；

RT-PCR反應體系如下：

以3-5μg總RNA、1μL?10?mM?smart^TMⅢ、1?μL?10?mM?BRL-A1、適量的DEPC?dH₂O、1?μL?20×RNAsafe在冰上配置反應混合液12?μL；

70℃反應10?min后放置于冰上；

將上一步反應產物渦旋混勻后，與4?μL?5×first-strand?buffer、2?μL?0.1M?DTT、1?μL?10?mM?dNTP、1?μL?SuperScript^TM?II?Reverse?Transcriptase（200?units/μL）在冰上配制20μL?cDNA合成反應液；

產物冰上放置1?min以終止第一鏈的合成，cDNA產物-20℃備用。

5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟三，擴增Tp18編碼區的實現方法為：

第一輪PCR時將cDNA稀釋10倍，擴增體系為25μL，其中PCR?mixture?12.5μL；10?pmol/μL正反向引物各1μL；模板cDNA?1μL，加滅菌超純水至25μL；

PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現目的片段，且有清晰可見的條帶，第二輪PCR擴增時將此產物稀釋100倍后擴增，如果無清晰條帶，第二輪時則將第一輪PCR產物稀釋10倍后擴增，擴增體系和條件同第一輪；

第二輪擴增后將PCR產物1%瓊脂糖電泳，切下目的片段膠條，使用柱式DNA膠回收試劑盒進行PCR產物的回收純化，回收產物測序3次。

6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，第一輪PCR的擴增條件為：94℃預變性5?min；35個循環，每個循環中94℃變性50?s，58℃退火45?s，72℃延伸50?s；最后72℃延伸10?min。

7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，Tp18基因的生物信息學分析的實現方法為：

利用Clustal?x?1.83程序對豆狀帶絳蟲、多頭帶絳蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲、亞洲帶絳蟲和羊帶絳蟲的18?kDa抗原氨基酸序列進行多重比對；利用PSIPRED和PredictProtein分析蛋白質的二級結構。