[發明專利]一種豆狀帶絳蟲18kDa抗原的制備方法及其應用

無效

• 申請號: 201210566303.0
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN103074344A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 楊光友;楊德英;彭雪蓉;古小彬
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明屬于基因生物學技術領域，尤其涉及一種豆狀帶絳蟲18?kDa抗原的制備方法及其應用。?

背景技術

豆狀帶絳蟲是犬科動物（終末宿主）和兔形目動物（中間宿主）的常見寄生蟲，其中絳期幼蟲引起的豆狀囊尾蚴病給家兔養殖業帶來了巨大的經濟損失。豆狀帶絳蟲呈世界性分布，成蟲寄生于犬、狐貍等終末宿主的小腸，中絳期幼蟲----豆狀囊尾蚴寄生于家兔等兔形目動物的肝臟被膜、胃大網膜和腸系膜等部位，可引起家兔消瘦和抗病力減弱，甚至死亡。中國是世界養兔大國，兔豆狀囊尾蚴病在我國廣泛流行，給養兔業帶來巨大的經濟損失。目前兔豆狀囊尾蚴病的防治仍以藥物為主，化學藥物的長期使用容易導致蟲株耐藥性的產生和兔產品的藥物殘留，同時也潛在地威脅著人類健康。要阻斷絳蟲的傳播途徑并獲得長期的防治效果，其中一個重要措施是篩選蟲體自身的保護性抗原制備疫苗。疫苗接種是防治寄生蟲病最適當的方法，不僅成本低，長期有效，而且對消費者和環境是安全的。天然蟲體抗原由于來源受到限制，臨床上很難推廣使用。?

發明內容

本發明提供了一種豆狀帶絳蟲18?kDa抗原的制備方法及其應用，旨在解決當篩選蟲體自身的保護性抗原制備疫苗來阻斷絳蟲的傳播途徑時，天然蟲體抗原由于來源受到限制，臨床上很難推廣使用的問題。?

本發明的目的在于提供一種豆狀帶絳蟲18?kDa抗原的制備方法，該制備方法包括以下步驟：?

步驟一，激活豆狀帶絳蟲六鉤蚴，并進行總RNA提取；?

步驟二，以總RNA為模板，合成cDNA；?

步驟三，擴增Tp18編碼區，并進行Tp18基因的生物信息學分析；?

步驟四，對Tp18進行原核表達，并純化表達蛋白。?

進一步，步驟一，激活豆狀帶絳蟲六鉤蚴，并進行總RNA提取的實現方法為：?

從自然感染的家兔體內采集新鮮的豆狀囊尾蚴感染犬，五周后收集節片并用PBS緩沖液洗凈后保存于4℃的保存液；?

將收集到的200個節片先用PBS緩沖液沖數次，在1.5?mL的離心管中剪碎，1%的胃蛋白酶液37℃孵育1?h，3000?r/min離心5?min收集蟲卵，并PBS緩沖液漂洗三次；?

用1%的次氯酸鈉溶液孵化蟲卵，在顯微鏡下觀察到卵殼破殼率達90%時，立即加入等量的0.2?M/L的硫代硫酸鈉終止反應，3000?r/min離心后5min用PBS緩沖液漂洗三次；?

加入含胰酶和兔膽汁的孵化激活液于37℃孵育45min，3000?r/min離心5min后棄上清，PBS緩沖液漂洗三次，利用0.4%的臺盼藍檢查激活六鉤蚴的活力；?

激活后的六鉤蚴活力達70%以上時，使用Trizol試劑進行總RNA的提取。?

進一步，保存液中包含100?IU/mL青霉素、0.l?mg/mL鏈霉素及0.25?mg/mL兩性霉素B。?

進一步，步驟二，以總RNA為模板，合成cDNA的實現方法為：?

根據四川農業大學動物寄生蟲學實驗室測序完成的豆狀帶絳蟲轉錄組數據，以總RNA為模板，利用SuperScriptTM?II?Reverse?Transcriptase，結合5’末端通用接頭引物smartTMⅢ和3’末端通用接頭引物BRL-A1進行逆轉錄PCR（RT-PCR）以合成cDNA的第一條鏈；?

RT-PCR反應體系如下：?

以3-5μg總RNA、1μL?10?mM?smart^TMⅢ、1μL?10?mM?BRL-A1、適量的DEPC?dH₂O、1μL?20×RNAsafe在冰上配置反應混合液12μL；?

70℃反應10?min后放置于冰上；?

將上一步反應產物渦旋混勻后，與4μL?5×first-strand?buffer、2μL?l?0.1M?DTT、1μL?10?mM?dNTP、1μL?SuperScript^TM?II?Reverse?Transcriptase（200?units/μL）在冰上配制20μL?cDNA合成反應液；?

產物冰上放置1?min以終止第一鏈的合成，cDNA產物-20℃備用。?

進一步，步驟三，擴增Tp18編碼區的實現方法為：?

第一輪PCR時將cDNA稀釋10倍，擴增體系為25μL，其中PCR?mixture?12.5μL；10?pmol/μL?正反向引物各1μL；模板cDNA?1μL，加滅菌超純水至25μL；?