[發(fā)明專利]一種提取質粒DNA的試劑和方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201210563585.9
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN103882007A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設計）人: 楊艷菊;何勝祥
• 申請（專利權）人: 蘇州中同生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種提取質粒DNA的試劑和方法。

背景技術

質粒DNA是基因工程常用的載體，可以攜帶外源基因進入細菌、動物細胞或植物體內進行擴增與表達，質粒DNA的提取和純化是分子生物學研究領域中應用最廣泛和最基本的技術，質粒提取的效率和質量對于后續(xù)實驗(酶切、PCR擴增和測序等)的成功與否有著直接的關系。目前在國內外，很多生物試劑公司都研制了與提取質粒技術相關的試劑盒，如普洛麥格(promega)、碧云天、生工等。該類試劑盒多以純化柱為主，成本高，價格昂貴，試劑繁雜且耗時較長。若以改良的堿裂解、酚—氯仿抽提方法提取質粒，獲得的質粒DNA產量低，質量不高，不能滿足下游的酶切和測序的要求，同時多種試劑混合應用，無疑加大了實驗的工作量，使得實驗時間顯著延長，影響生物學實驗操作和實驗結果。

發(fā)明內容

本發(fā)明解決了以上不足，提供了一種提取質粒DNA的試劑和方法，本發(fā)明所用提取質粒的試劑成本低，提取質粒DNA的方法操作簡單，且本發(fā)明所述的試劑和方法提取出的質粒產量高、純度高，本發(fā)明具有快速、高效、高質且成本低的優(yōu)點。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術方案：

一種提取質粒DNA的試劑，其特征在于它包括菌體裂解試劑、蛋白抽提試劑、質粒DNA沉淀試劑和質粒DNA溶解試劑；所述菌體裂解試劑的組分為：10mM?Tris-HCl、1mM?EDTA、150mM氯化鈉和5mg/ml溶菌酶，以超純水為溶劑，所述Tris-HCl的PH值為7.5-7.8；所述蛋白質抽提試劑的組分為酚和氯仿的體積比為1∶1的混合物；所述質粒DNA沉淀試劑的組分是PH為7.5的5.5M醋酸鈉溶液和無水乙醇，其中醋酸鈉溶液和無水乙醇體積比為1∶4；所述質粒DNA溶解試劑的組分為含有0.15mg/ml?RNase的超純水。

本發(fā)明還提供了一種提取質粒DNA的方法，它包括以下步驟：

(1)搖菌擴增質粒；將攜帶質粒的大腸桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基中，挑選單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)，置于在30-37.5℃恒溫搖床上培養(yǎng)，搖床轉速為200-250轉/分鐘；

(2)取培養(yǎng)12-15小時OD₆₀₀達到0.5～0.6之間的生長狀態(tài)良好的細菌菌液1.5ml于1.5ml離心管，室溫下以12000g離心30秒，棄上清；

(3)沉淀中加入100μl所述菌體裂解試劑，充分振蕩混勻；

(4)加入100μl所述蛋白抽提試劑，置于渦旋振蕩儀上混勻5秒鐘；

(5)室溫下以12000g離心5分鐘以釋放質粒DNA；

(6)收集上清，切勿觸動蛋白質界面；

(7)加入20μl質粒DNA沉淀試劑和200μl的無水乙醇，顛倒混勻；

(8)室溫下以12000g離心1分鐘以沉淀質粒DNA；

(9)棄上清，并干燥質粒DNA；

(10)用50μl質粒DNA溶解試劑溶解質粒DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

與現(xiàn)有產品相比，本發(fā)明的優(yōu)點是：本發(fā)明的所用試劑采用溶菌酶溶解細菌，通過酚-氯仿一步法去除蛋白質和RNA。用本發(fā)明所述提取質粒的方法提取質粒的操作時間短，提取一種質粒的時間只需8分鐘；本發(fā)明所用提取質粒的試劑組成簡單，均為常見實驗試劑，來源廣泛且價格低，各組分均可以采用國產分析純就可以提取到高產量和純度的質粒，大大降低了費用；獲得的質粒DNA產量高，純度好，無蛋白和RNA的污染，滿足分子生物學相關實驗要求，提取到的質粒DNA可以直接用于下游的酶切、連接、測序、原核轉化和真核轉染等實驗，大大方便了生物實驗操作，節(jié)省了實驗時間，提高了實驗效率。

附圖說明：

圖1，不同方法產品所提取的質粒DNA圖譜

(M為標準分子量，1、2為promega純化試劑盒，3、4為使用碧云天柱式純化盒所提取的相應質粒DNA，5、6為使用本發(fā)明方法所提取的質粒DNA)

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細的說明。

實施例1

本發(fā)明所述的提取質粒DNA的試劑包括四種試劑，分別為菌體裂解試劑R1；蛋白抽提試劑R2；質粒DNA沉淀試劑R3；質粒DNA溶解試劑R4。

所述菌體裂解試劑R1：

組分：10mM?Tris-HCl(pH?7.8)；

1mM??EDTA；

150mM氯化鈉；

5mg/ml溶菌酶。

按如下方法配制100ml的試劑R1：