[發明專利]一種提取質粒DNA的試劑和方法

在審

• 申請號: 201210563585.9
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN103882007A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 楊艷菊;何勝祥
• 申請（專利權）人: 蘇州中同生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種提取質粒DNA的試劑，其特征在于它包括菌體裂解試劑、蛋白質抽提試劑、質粒DNA沉淀試劑和質粒DNA溶解試劑；所述菌體裂解試劑的組分為：10mM?Tris-HCl、1mM?EDTA、150mM氯化鈉和5mg/ml溶菌酶，以超純水為溶劑，所述Tris-HCl的PH值為7.5-7.8；所述蛋白質抽提試劑的組分為酚和氯仿的體積比為1∶1的混合物；所述質粒DNA沉淀試劑的組分是PH為7.5的5.5M醋酸鈉溶液和無水乙醇，其中醋酸鈉溶液和無水乙醇體積比為1∶4；所述質粒DNA溶解試劑的組分為含有0.15mg/ml?RNase的超純水。

2.一種根據權利要求1所述的試劑提取質粒DNA的方法，其特征在于它包括以下步驟：

(1)搖菌擴增質粒；將攜帶質粒的大腸桿菌接種于LB固體培養基中，挑選單克隆菌落接種于LB液體培養基擴增培養，置于在30-37.5℃恒溫搖床上培養，搖床轉速為200-250轉/分鐘；

(2)取培養12-15小時OD₆₀₀達到0.5～0.6之間的生長狀態良好的細菌菌液1.5ml于1.5ml離心管，室溫下以12000g離心30秒，棄上清；

(3)沉淀中加入100μl所述菌體裂解試劑，充分振蕩混勻；

(4)加入100μl所述蛋白抽提試劑，置于渦旋振蕩儀上混勻5秒鐘；

(5)室溫下以12000g離心5分鐘以釋放質粒DNA；

(6)收集上清，切勿觸動蛋白質界面；

(7)加入20μl質粒DNA沉淀試劑和200μl的無水乙醇，顛倒混勻；

(8)室溫下以12000g離心1分鐘以沉淀質粒DNA；

(9)棄上清，并干燥質粒DNA；

(10)用50μl質粒DNA溶解試劑溶解質粒DNA，-20℃保存備用。