[發明專利]一種驗證二硫鍵對木聚糖酶熱穩定性影響的方法

無效

• 申請號: 201210562636.6
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN102978224A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;余濤;殷欣;李劍芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
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技術領域

本發明涉及源自11家族耐熱雜合木聚糖酶AEx11A結構的同源建模及其與AoXyn11A結構的比對分析，突變木聚糖酶AEx11A^C5T工程菌的構建以及突變木聚糖酶的高效表達、純化和活性測定的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

木聚糖酶(EC?3.2.1.8)是一類重要的工業用酶。它主要是作用于木聚糖主鏈，隨機地切開木聚糖內部的木糖苷鍵，水解產物主要為不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最關鍵的酶。近幾年，由于木聚糖酶在飼料工業、食品加工及釀造等行業具有潛在的工業應用和經濟價值，尤其是在工業造紙上的應用，減少因漂白產生的環境污染，受到了越來越多的關注。然而在許多工業中，木聚糖酶都需要在高溫條件下進行操作，因此對木聚糖酶熱穩定性的研究也引起了國內外研究的高度重視。

根據木聚糖酶催化區域的結構和性質分析，可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于11家族的木聚糖酶分子量較小，且結構比較簡單，更適合作為理論研究的分子模型。許多研究結果表明11家族木聚糖酶的N末端區域對其穩定性起著很重要的作用。Lee等人對木聚糖酶XynA的N端進行刪除突變，突變酶的熱穩定性喪失但活性不變，從而確定了N端是其熱穩定區，盧雪麗等人引入二硫鍵提高黑曲霉XynIII熱穩定性的研究。但N端二硫鍵對11家族耐熱雜合木聚糖酶AEx11A的熱穩定性分析未見有文獻或專利報告。本發明能為11家族木聚糖酶AEx11A的熱穩定機制的闡明、熱穩定性蛋白工程的改造等奠定理論基礎。

發明內容

本發明的目的是提供一種新型地利用計算機和生物信息學知識，對11家族木聚糖酶AEx11A結構的同源建模及其與AoXyn11A結構的比對分析，運用基因工程的方法構建突變木聚糖酶工程菌以及突變木聚糖酶的高效表達、酶活性、最適溫度的測定方法。

本發明的技術方案：一種源自11家族木聚糖酶AEx11A結構的同源建模及其與AoXyn11A結構的比對分析后，得出在端引入了一個二硫鍵(Cys⁵-Cys³²)，利用定點突變法將5位的半胱氨酸突變為蘇氨酸(C5T)突變前后的基因分別為AEx11A和AEx11A^C5T。AEx11A^C5T基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1。

11家族木聚糖酶pPIC9K-AEx11A由江南大學醫藥學院分子生物學實驗室制備和保藏。

所述的由完整mRNA序列推導的AEx11A^C5T氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2。

所述的突變木聚糖酶的活性測定方法：

于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH?4.6、檸檬酸-Na₂HPO₄緩沖液配制的質量濃度為0.5％的樺木木聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃預熱10min，在A管中加入0.1mL適當稀釋的酶液，50℃準確反應15min；立即各加入2.5mL?3′，5′-二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從木糖標準曲線上查出相應的還原糖(以木糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義：在本測定條件下，以每分鐘產生1μmol還原糖所需的酶量定義為1個木聚糖酶活性單位(IU)。

所述的突變酶的最適溫度和熱穩定性的測定：

在不同溫度下，按上述方法測定酶活性，以最高酶活性為100％計算相對酶活性。T_opt表示最適溫度。將酶液置于不同溫度下保溫不同時間，按上述方法測定殘余酶活性，以未處理的酶活性為100％。t_1/2^A表示在A℃下酶的半衰期，即殘余酶活性為50％時的保溫時間。

所述的突變木聚糖酶基因的設計、克隆及表達：