[發明專利]一種驗證二硫鍵對木聚糖酶熱穩定性影響的方法

無效

• 申請號: 201210562636.6
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN102978224A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;余濤;殷欣;李劍芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
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1.一種對來源于米曲霉Aspergillus?oryzae的11家族的雜合木聚糖酶AEx11A進行耐熱分析。通過對AEx11A結構的同源建模及其與AoXyn11A結構的比對分析，定向突變以研究熱穩定提高的原因，突變后的核苷酸(AEx11A^C5T)序列為SEQ?ID?NO：1。

2.由權利要求1所述的突變的木聚糖酶基因(AEx11A^C5T)編碼的突變木聚糖酶(AEx11A^C5T)，其完整的氨基酸序列對應于序列表中的為SEQ?ID?NO：2。

3.AEx11A結構的同源建模及其與AoXyn11A結構的比對分析：

同源建模AEx11A的空間結構：登錄蛋白質結構數據庫Protein?data?bank(http://rcsb.org)，經BLAST比對，找到與AEx11A一級結構具有高度同源的，分別來自繩狀青霉菌Penicilliumfuniculosum(1TE1)、E.coli(2VUL)和紅褐肉座菌Hypocrea?jecorina(1ENX)的11家族木聚糖酶晶體結構，作為同源建模的模板；其相似性分別為63.7％、78.8％和60.9％。利用SALIGN(http://salilab.org/DBAli/？page＝tools_&action＝f_salign)和MODELLER?9.9(http://salilab.org/modeller/)程序對AEx?11A進行同源建模；

經比對發現由于N端替換，在AEx11A分子結構中引入了一個二硫鍵(Cys⁵-Cys³²)，其連接兩個反向平行的β-折疊股(A1和A2)，可能會通過降低蛋白質解折疊狀態的熵，而對其熱穩定性提高有一定的作用。

4.突變木聚糖酶工程菌的構建和表達方法：

(1)突變基因AEx11A^C5T及表達質粒的構建

根據pPIC9K-AEx11A(本實驗是保存)設計引物，將其中的Cys⁵突變為Thr⁵

F1：5′-GA?ATTCAACGCTCAAACTactCTTACCTCT-3′，含EcoR?I酶切位點和突變點Thr⁵

R1：5′-GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAATAGCAG-3′，含Not?I酶切位點

以pPIC9K-AEx11A為模板，以F1和R1為引物進行PCR反應。94℃2min；30個循環，94℃30s，55℃30s，72℃40s；72℃10min。將PCR的目的條帶進行克隆、測序；測序正確的pUCm-T-AEx11A^C5T與pPIC9K質粒均用EcoR?I和Not?I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-AEx11A^C5T，并對重組質粒進行測序鑒定；

(2)GS115/AEx11A^C5T的構建、表達、產物純化及活性測定

用Sal?I對pPIC9K-AEx11A^C5T進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AEx11A^C5T；該工程菌用1.0％甲醇誘導72h，DNS法測得發酵液中突變木聚糖酶活性與原酶AEx11A基本一致。發酵液經離心后的上清液為突變AEx11A^C5T粗酶液，經截留分子量為10kDa的超濾膜濃縮，再經DEAE-Sepharose?Fast?Flow離子交換層析和Sephadex?G-75凝膠過濾層析純化，純化后經SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示突變木聚糖酶分子量與原酶AEx11A基本一致；該突變木聚糖酶最適作用溫度60℃，低于原酶AEx11A的最適溫度85℃；其t_1/2⁷⁰和t_1/2⁸⁰分別為3.0、1.0min低于原酶AEx11A的197和25min。