[發(fā)明專利]一種環(huán)氧化物水解酶基因(EH-B)原核表達及手性環(huán)氧氯丙烷的制備

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210562633.2
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN102994470A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李劍芳;胡蝶;王春娟;朱天地;鄔敏辰
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12N15/10;C12N15/70;C12R1/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種來源于Aspergillus?usamii?E001的新型B類環(huán)氧化物水解酶，其cDNA序列和氨基酸序列分別為SEQ?IDNO：1和SEQ?IDNO：2。

2.A.usamii?E001新型環(huán)氧化物水解酶B基因序列克隆及表達的方法：

(1)從已克隆的A.usamii?E001基因cDNA序列，然后對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預(yù)測，根據(jù)預(yù)測的結(jié)果設(shè)計一對特異性引物，引物序列如下：

AuEHB-F：5′-GAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAA-3′，含EcoR?I酶切位點；

AuEHB-R：5′-GCGGCCGCTCATTTTCTACCAGCCCATAC-3′，含Not?I酶切位點；

提取A.usamii?E001的總RNA，按照TaKaRa生產(chǎn)的RNA?PCR?Kit(AMV)Ver.3.0中的說明書進行RT-PCR：以O(shè)ligo?dT-Adaptor?Primer為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer?M4和AuEHB-F為引物進行第一輪PCR(94℃，2min；94℃，30s，51℃，30s，72℃，80s，30個循環(huán)；72℃，10min)；以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板、AuEHB-F和AuEHB-R為引物進行第二輪PCR(94℃，2min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，70s，30個循環(huán)；72℃，10min)；將兩輪PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp?DNA?LadderMarker做對照，將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AusEH-B，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得到Aus?EH-B成熟肽cDNA序列；

(2)將測序結(jié)果正確的pUCm-T-AusEH-B與pEH-28-a-c(+)質(zhì)粒均用EcoR?I和Not?I進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質(zhì)粒pEH-28-a-AusEH-B，并對重組質(zhì)粒進行序列測定；

(3)E.coli?Rosetta(DE3)/EH-B的構(gòu)建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定：將pEH-28-a-AusEH-B轉(zhuǎn)化E.coli?Rosetta(DE3)，在含有氯霉素及Kna抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子；重組質(zhì)粒EcoR?I和Not?I酶切驗證；挑去陽性轉(zhuǎn)化子于2mL含Kna/氯霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，以1％的接種量轉(zhuǎn)接到30mL相同培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(OD600為0.6～0.8)，加人IPTG至終濃度為0.5mmol/L，誘導(dǎo)過夜；同時以未誘導(dǎo)工程菌及含空質(zhì)粒的菌株為陰性對照；誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體并冷凍干燥，測定手性氣相色譜環(huán)氧化物水解酶活性。