[發明專利]一種環氧化物水解酶基因(EH-B)原核表達及手性環氧氯丙烷的制備

無效

• 申請號: 201210562633.2
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN102994470A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 李劍芳;胡蝶;王春娟;朱天地;鄔敏辰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12N15/10;C12N15/70;C12R1/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及來源于宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)E001菌株的一種新型B型環氧化物水解酶(Aus?EH-B)基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達，利用生物手性拆分制備手性環氧苯乙烯的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

手性化合物是重要的手性配體，廣泛用于各類不對稱反應中，特別是在藥物合成領域的應用更為廣泛。手性環氧氯丙烷是一種重要的有機合成關鍵中間體，用以制備多種高光學純度藥物中間體和天然產物，如芳氧丙醇胺類藥物、環戊酮的衍生物、抗真菌藥(S)-霉康靈、阿伐他汀、L-肉堿等。目前，外消旋的環氧氯丙烷價廉易得，而手性環氧氯丙烷的價格昂貴，后者的報價基本在前者6倍以上，因此通過拆分外消旋環氧氯丙烷制備其手性單體具有很大的工業化應用前景。其拆分剮產物3-氯-1，2-丙二也是一種重要的手性合成原料。拆分外消旋環氧氯丙烷的方法可分為化學法和生物法兩類：化學法通常使用昂貴的S?len-Co催化劑，可獲得ee達到99％的(S)-環氧氯丙烷收率可達30％，其缺點是成本高而且環境污染嚴重。

環氧化物水解酶(Epoxide?hydrolase，EC，3.3.2.-)又稱環氧化物水合酶或環氧水化酶，是一類催化水分子立體選擇性的加成環氧化物水解為相應1，2-二醇的水解酶類。在化學法和生物法制備手性純環氧化物的方法中，酶動力學拆分法由于其高的對映體選擇一直受成為廣大研究者的重視。該酶廣泛存在于植物、昆蟲、哺乳動物及微生物體內。環氧化物水解酶是一種不依賴輔因子的酶，其來源廣泛，底物譜寬廣，對映體選擇性高，具有很高的工業化應用前景，對其研究已成為當前研究的熱點。

環氧化物水解酶微生物來源廣泛，但具有良好手性拆分作用的環氧化物水解酶較少，Botes等以1，2-環氧辛烷為底物從187個菌株中篩選出25個不同屬的酵母具有環氧化合物水解酶活性的菌株，Yeates等以硝基環氧苯乙烯為底物從409個菌株中篩選出45個不同屬的酵母具有水解底物活性，但只有3個擔子菌屬菌株酵母的環氧化合物水解酶選擇性較高，即毛孢子菌屬(Trichosporon)、紅冬孢子屬(Rhodosporidium)和紅酵母屬(Rhodotorula)。Furstoss和Archelas等從眾多菌株中篩選一株Aspergillus?niger?LCP?521進行環氧化合物的不對稱水解，合成了6，7-雙羥基香葉醇。目前對于環氧化物水解酶的研究，主要集中于對原始菌株培養條件的優化以增加產酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技術和蛋白質工程技術來提高環氧化物水解酶的立體選擇性。

本發明來源于宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)E001菌株具有環氧化物水解酶酶活性，提供一種新型B型環氧化物水解酶(Aus?EH-B)基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達。基因工程環氧化物水解酶純度高、不含其他蛋白酶，立體選擇性更強；大腸桿菌表達系統具有高效胞內表達重組蛋白，成本低廉、生產率高、操作簡單等優勢；且由于一般底物為有機溶劑，酶分子受底物濃度抑制作用，胞內表達宿主菌包膜形成天然保護屏障，更有利于在高底物濃度下進行生物催化，適應工業化生產要求；本發明利用重組環氧化物水解酶制備手性環氧苯乙烯的研究未見報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種源于Aspergillus?usamii?E001的新型B類環氧化物水解酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達，利用重組環氧化物水解酶制備手性環氧苯乙烯的方法，為該環氧化物水解酶的產業化生產奠定基礎。根據酶的亞細胞定位及底物的特異性將EH分為可溶性環氧化物水解酶(sEH)、微粒體環氧化物水解酶(mEH)，保幼激素環氧化物水解酶(JhEH)，膽固醇環氧化物水懈酶(ChEH)，羥環氧烯酸水解酶(hepoxilinhydrolase)，白三烯A4水解酶(LAH)以及檸檬烯水解酶(LEH)七個亞家族。生物信息學分析表明，來源于宇佐美曲霉E001菌株的一種新型環氧化物水解酶屬于微粒體環氧化物水解酶(mEH)類，屬于曲霉EH中一類新型環氧化物水解酶。由于與研究較多A.Niger?LCP521EH同源性僅為56％，將該酶命名為Aus?EH-B，其相應的基因命名為Aus?EH-B。Aus?EH-B具有較高的催化活性和手性選擇性，在手性環氧化物生產中有較大的工業化生產和應用潛力及經濟價值。