[發明專利]一種LKB1蛋白檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201210562574.9
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN103884694A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 萬曉春;王偉;粟武
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/533
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 宋鷹武

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種LKB1蛋白檢測方法及試劑盒。

背景技術

人LKB1（Liver?Kinase?B1）基因或稱STK11（Serine-Threonine?kinase?11）基因，定位于人染色體19p13.3位置，含10個外顯子，編碼的LKB1蛋白由433個氨基酸組成，分子量約為50kDa，包括激酶區域（44-309）、N端調節域和C端調節域。N端調節域含一個核定位序列，使LKB1蛋白定位于細胞核內。LKB1基因編碼一種絲-蘇氨酸蛋白激酶，參與多種生物學過程，包括細胞周期阻滯、p53介導的凋亡、細胞極性誘導等，介導TGF-β、G蛋白偶聯等信號通路，在細胞生長、分化調控中發揮著重要作用，幾乎在人體多種組織中均有表達，以上皮、睪丸生精小管、肝臟、小腸和骨骼肌最多。LKB1基因是腫瘤易患綜合癥，即PJ綜合征（Peutz-Jeghers?syndrome，PJS）的致病基因，在高達90%的PJS病人中可檢測到LKB1基因的胚系突變。LKB1基因的功能異常還與全身多種散發性腫瘤的發生密切相關，如在30-40%的非小細胞肺癌、20%的宮頸癌、19%鱗狀細胞癌及13%乳腺侵潤性導管癌中均有LKB1基因的失活。另外，LKB1基因在惡性腫瘤發生中起著重要作用，已有研究證實LKB1能夠使細胞周期停滯在G1期，抑制細胞生長。LKB1基因是一個較為普遍的抑癌基因。LKB1基因表達情況對腫瘤發生和預后影響都是一個重要的中間指標，對揭示LKB1基因抑制細胞惡性增殖的分子背景有重要的意義，因此，LKB1基因表達情況的檢測，即LKB1蛋白水平檢測或LKB1mRNA的水平檢測是亟待解決的問題。

目前，LKB1蛋白的檢測方法主要為免疫組織化學法，一種現有技術利用兔源多克隆抗體作為一抗，然后用標記了化學顯色試劑或者熒光基團的二抗對一抗進行標記，一抗與LKB1蛋白結合后再用化學顯色試劑的顏色或者熒光基團的熒光信號來判斷LKB1蛋白的豐度。這種間接的檢測方法步驟繁瑣耗時長，并且由于多克隆抗體的特異性不強導致非特異性信號的產生，對檢測結果的準確性有很大影響。還有一種現有技術是利用DAB顯色的原理，對LKB1鼠源單克隆抗體進行顯色標記，然后LKB1抗原免疫組化染色，再用光學顯微鏡觀察，出現棕黃色或棕褐色的為陽性，綜合考慮陽性細胞著色深淺和陽性細胞占所觀察同類細胞的比例兩項指標，進行半定量判斷結果。這種方法中使用的DAB染色劑有毒性，為疑似致癌物質，不安全，另外，顯色劑顯色反應受溫度影響大，且顯色時間受到限制，不能長期保存，實驗人員無法將組織切片保存進行重復觀察。

量子點具有寬的激發光譜和窄的發射光譜（光譜寬在20-40nm之間），通過改變量子點的尺寸或者改變量子點內核的組分可以在很大范圍內調節量子點的發射光譜。量子點與有機熒光團相比有幾個突出的光學特點：窄的發射光譜能減少光譜重疊，從而能同時區別多個熒光團；寬的激發光譜能在單一波長下激發多種顏色的光譜。此外量子點具有光穩定性和抗降解性，對細胞的毒性小。這些獨特的光學性質使量子點能在體內跟蹤多個細胞和制備體外多個分子生物傳感器，而且由于量子點的可調諧的發光波長，使量子點能促進組織深層的細胞成像。

發明內容

本發明旨在解決上述現有技術中存在的問題，提出一種LKB1蛋白檢測方法，包括以下步驟：

用量子點標記LKB1單克隆抗體，得到量子點LKB1單克隆抗體；

用量子點LKB1單克隆抗體與標本反應；

將反應后的標本置于顯微鏡下觀察，

其中，所述的標本為細胞標本或組織標本，所述的細胞標本為組織印片、細胞爬片或細胞涂片，所述的組織標本為石蠟切片或冰凍切片。

優選地，所述的用量子點標記LKB1單克隆抗體包括以下步驟：

將量子點表面用GHS進行修飾，得到GSH-量子點；

在GSH-量子點中加入SMCC，形成SMCC-GHS-量子點；

將SMCC-GHS-量子點與LKB1單克隆抗體反應，得到量子點LKB1單克隆抗體。

優選地，所述的將量子點表面用GHS進行修飾為：

將量子點加入到GHS中進行反應，得到第一反應液；

將第一反應液離心，收集沉淀；

將所得沉淀用potassium?t-butoxide溶液溶解，得到第二液體；

將第二液體透析，去除第二液體中的GSH與potassium?t-butoxide，得到GSH-量子點。

優選地，所述的SMCC-GHS-量子點的制備方法為：