[發明專利]一種米曲霉阿魏酸酯酶基因(faeA)的克隆及表達

無效

• 申請號: 201210562540.X
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN102978180A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;曾妍;龔燕燕;李劍芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N15/81
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技術領域

本發明涉及來源于米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186菌株的一種新型A型阿魏酸酯酶(faeA)基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達，屬于生物工程技術領域。

背景技術

阿魏酸(ferulic?acid)是肉桂酸的一種，化學名是(3-甲基-4-羥基)-3-苯基-2-丙烯酸，或者3-甲基-4-羥基肉桂酸，是植物界普遍存在的一種酚酸，其在植物細胞壁結構中起著重要的作用，可以在植物細胞壁的木質素與木質素之間、木質素與半纖維素之間、半纖維素與半纖維素之間形成交接，從而構成一個骨架結構，使得整個細胞壁變得堅硬。在谷物的細胞壁中，阿魏酸的單體和多種二聚體主要以酯鍵的形式連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上。阿魏酸主要的生理功能有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病，并具有抗菌消炎以及抗突變和防癌作用。反式阿魏酸在美國、日本已允許用作食品添加劑，目前在醫藥、食品和化妝品工業中廣泛應用。

阿魏酸酯酶(EC.3.1.1.73)又稱肉桂酸酯酶、肉桂酰酯酶，是羧酸水解酶的一個亞類，也是一種胞外水解酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚阿魏酸酯和多聚阿魏酸酯中的酯鍵，一方面促進半纖維素、木素與纖維素的分離，有利于纖維素的進一步利用；另一方面促進阿魏酸等酚酸類物質的分離。阿魏酸酯酶在生物乙醇生產、制漿造紙、動物飼料生產和生物合成中具有廣泛的應用價值。目前對于阿魏酸酯酶的研究，主要集中于對原始菌株培養條件的優化以增加產酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技術和蛋白質工程技術來提高阿魏酸酯酶的酶活。

近年來，隨著對自然界半纖維素資源的開發利用，尤其是反式阿魏酸優越的生理功能，人們對不同來源和不同特性的阿魏酸酯酶進行了深入地研究，阿魏酸酯酶的應用領域得到了不斷地拓展，除了在食品方面的利用，其在造紙、飼料、紡織、釀酒、醫藥、環境和能源等工業領域逐步開始了廣泛的應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種源于Aspergillus?oryzae?CICC?40186的新型A類阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表達的方法，為該阿魏酸酯酶的產業化生產奠定理論基礎。根據氨基酸序列以及底物特異性等，將阿魏酸酯酶分為A、B、C、D四類，Shin等研究表明這四類阿魏酸酯酶都含有不同的保守序列和基序。根據同源比對，Aspergillus?oryzae?CICC?40186分泌的為A型阿魏酸酯酶，命名為Aor?FaeA，其相應的基因命名為Aor?faeA。

A.oryzae菌株購于中國工業微生物菌種保藏中心(China?Center?of?Industrial?CultureCollection，CICC)，編號為40186。

本發明的技術方案：一種源自A.oryzae?CICC?40186的新型的A類阿魏酸酯酶(Aor?FaeA)，其基因(Aor?faeA)成熟肽cDNA核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1。

所述的由成熟肽cDNA序列所推導的Aor?FaeA氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2。

所述的重組阿魏酸酯酶的活性測定方法：

以對硝基苯酚阿魏酸酯(pNPF)作為反應底物，反應體系為200μL，緩沖體系為25mmol/LpH6.4的磷酸緩沖液(含2.5％Tritonx-100)，對硝基苯酚阿魏酸酯(溶于DMSO)終濃度為0.6mmol/L，加入100μL的酶，測定產物對硝基苯酚在410nm處吸光度。同時設置空白對照(100μL粗酶液于沸水浴中滅酶3min，其他操作步驟同上)。

醋酶活力定義：在上述反應條件下，每分鐘催化底物水解生成1μmoL對硝基苯酚所需要的酶量為一個活力單位(U)。

所述的Aor?faeA成熟肽cDNA序列的克隆和表達的方法如下：

(1)從已報道的Aspergillus?oryzae?RIB?40基因組信息中找出編碼米曲霉A類阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預測，根據預測的結果設計一對特異性引物，引物序列如下：

FAE-F：5’GAATTCGCAATCACTCAGGGGATCT?3’

FAE-R：5’GCGGCCGCCTACCATGTACAGGCTCCG?3’