[發明專利]一種米曲霉阿魏酸酯酶基因(faeA)的克隆及表達

無效

• 申請號: 201210562540.X
• 申請日: 2012-12-24
• 公開（公告）號: CN102978180A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;曾妍;龔燕燕;李劍芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N15/81
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種來源于Aspergillus?oryzae?CICC?40186的新型A類阿魏酸酯酶，其核苷酸和氨基酸序列分別為SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。

2.A.oryzae?CICC?40186新型A類阿魏酸酯酶基因序列克隆及表達的方法：

(1)從已報道的Aspergillus?oryzae?RIB?40基因組信息中找出編碼黑曲霉A類阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預測，根據預測的結果設計一對特異性引物，引物序列如下：

FAE-F：5’GAATTCGCAATCACTCAGGGGATCT?3’

FAE-R：5’GCGGCCGCCTACCATGTACAGGCTCCG?3’

提取A.oryzae?CICC?40186的總RNA，按照TaKaRa?RNA?PCR?Kit(Ver.3.0)說明書進行RT-PCR擴增；將兩輪PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T載體連接(pUCm-T-faeA)，轉化大腸桿菌JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到AorfaeA成熟肽cDNA序列；

(2)將測序結果正確的pUCm-T-faeA與pPIC9K質粒均用EcoR?I和Not?I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-faeA(圖1)，并對重組質粒進行序列測定；

(3)GS115/faeA的構建、表達、產物純化及活性測定：用Sac?I對pPIC9K-faeA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/faeA；按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用紫外吸收法測定重組阿魏酸酯酶活性。