[發明專利]雙齒圍沙蠶β-1,4-內切葡聚糖酶基因序列及其克隆方法

無效

• 申請號: 201210562478.4
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN103882040A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 張倩茹;牟文燕;魏樹和;周啟星
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明屬于分子生物學中基因克隆領域，具體的說是一種雙齒圍沙蠶β-1,4-內切葡聚糖酶（EG）基因序列及其克隆方法。

背景技術

纖維素酶（cellulase）是能將纖維素水解成葡萄糖的一組酶的總稱。高等動物體內是不產生纖維素酶的，而在蝸牛、螞蟻、蚯蚓等少數低等無脊椎動物體內可以產生纖維素酶；草食動物瘤胃及盲腸中微生物產生的纖維素酶通過降解纖維素為草食動物提供能量。纖維素復合酶的水解作用是纖維素被徹底分解的有效途徑。纖維素酶系是一種多組分的復合酶，一般包括內切型葡聚糖酶（EC3.2.1.4，也稱C_x酶、CMC酶）、外切型葡聚糖酶（EC3.2.1.91,也稱C₁酶、微晶纖維素酶）和β-葡萄糖苷酶（EC3.2.21,簡稱βG或纖維二糖酶）等3種主要成分。有關纖維素酶的水解機理至今仍未完全清楚，但普遍認為：首先外切纖維素酶使結晶結構的纖維素長分子鏈開裂，聚集結構解聚，長鏈分子末端部分發生游離，為纖維素水解酶的作用提高可及性和反應性，從而使纖維素易于水化；然后內切酶作用于經外切酶活化的纖維素，分解分子中β-1,4-糖苷鍵，產生纖維二糖、三糖等短鏈低聚糖；最后β-葡萄糖苷酶將纖維二糖等低聚糖水解成葡萄糖分子。天然纖維素水解成葡萄糖的過程須依靠這三種酶的協調作用才能完成，而內切葡聚糖酶（endoglucanase,簡稱EG）是纖維素復合酶中的重要組成部分，作用于纖維素分子內部的非結晶區，隨機水解β-1,4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產生大量帶非還原性末端的小分子短鏈低聚糖，這些產物容易被β-葡萄糖苷酶降解為葡萄糖分子，而葡萄糖分子是很重要的生物能源。因此，對β-1,4-內切葡聚糖酶進行研究是十分必要的。

雙齒圍沙蠶（Perinereisaibuhitensis）屬環節動物門多毛綱沙蠶科，作為潮間帶地區的常見物種，是各種魚類、甲殼類和海鳥的重要食餌。由于沙蠶位于水陸生態食物鏈的底部，能攝食底泥中的沉積物、有機碎屑和微生物等，此外，對重金屬和某些工業有機污染物具有一定積累和消化作用，因此被認為是多毛類中耐污染能力較強的底棲生物。多毛類沙蠶可以很好地利用底質中的有機污染物和一些重金屬轉化為自身的生產力，它們作為海洋食物鏈中的一個分室既是生產單元，又能夠凈化底質，使系統內部的廢棄物再利用和循環，增加環境生態效益，其體內必然存在某種解毒和防御機制，而從我們過往研究中發現雙齒圍沙蠶的β-1,4-內切葡聚糖酶能夠對某些污染脅迫產生反應。因此，研究沙蠶纖維素蛋白基因對揭示和利用其解毒防御系統功能具有重要意義，同時也為纖維素酶其它功能的篩選及應用奠定了基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種雙齒圍沙蠶β-1,4-內切葡聚糖酶基因序列及其克隆方法。

為實現上述目的本發明采用的技術方案為：

一種雙齒圍沙蠶β-1,4-內切葡聚糖酶基因序列，雙齒圍沙蠶β-1,4-內切葡聚糖酶基因序列為SEQ?ID?NO.1中核苷酸序列所示。

雙齒圍沙蠶β-1,4-內切葡聚糖酶基因序列編碼蛋白為SEQ?ID?NO.2中氨基酸序列所示。

雙齒圍沙蠶β-1,4-內切葡聚糖酶基因序列的克隆方法，首先從雙齒圍沙蠶組織中提取總RNA；而后采用下游外側特異性引物EG-Outer-R（5'-TTCCTGTCTGCT?CCATATCC-3'）和下游內側特異性引物EG-Inner-R（5'-GTTAGGTCCTGG?CCATTGTT-3'）進行5’-RACE反應，克隆得到β-1,4-內切葡聚糖酶基因5’端序列；再利用反向引物EG-F進行RT-PCR反應，克隆得到β-1,4-內切葡聚糖酶基因3’端序列，反向引物EG-F:5'-AACAGACCTGCTTGGAGCAT-3'；通過序列片段拼接矯正，最終獲得β-1,4-內切葡聚糖酶基因核苷酸序列SEQ?ID?NO.1。

本發明具有如下優點：

1.采用本發明對雙齒圍沙蠶β-1,4-內切葡聚糖酶基因的成功克隆和測序，首次確定其全部編碼序列和部分非編碼序列，從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列，該序列可以用以設計引物再克隆該基因，也可以根據該序列或該序列所推導的氨基酸序列對該基因進行重組表達或基因轉移。

2.雙齒圍沙蠶β-1,4-內切葡聚糖酶基因的成功克隆和測序，為進一步分析纖維素酶影響下生物抗逆能力，為纖維素酶其它功能的篩選及應用奠定了基礎；

3.利用本發明所得β-1,4-內切葡聚糖酶基因對不同濃度污染物的表達情況來作為污染早期預警工具提供了方法學的指導。

附圖說明