[發明專利]一種提高靈芝菌絲生長速度和液體發酵生物量的方法

無效

• 申請號: 201210560884.7
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN102972211A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 苗敬芝;董玉瑋;陳尚龍;李勇
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: A01G1/04
• 分類號: A01G1/04;C12N15/01;C05G3/00
• 代理公司: 徐州市淮海專利事務所 32205
• 代理人: 華德明

技術領域

本發明涉及一種微生物遺傳育種方法，特別是一種提高靈芝菌絲生長速度和液體發酵生物量的方法。

背景技術

含有靈芝多糖、三萜類、靈芝多肽等十多種有效成分，試驗證明靈芝具有抗炎、鎮痛、鎮靜、抗衰老、抗腫瘤、抗缺氧、提高免疫力等作用。液體深層發酵技術是獲得靈芝主要藥理活性物質的重要途徑，但是一方面靈芝菌絲生長速度較慢，與靈芝菌種的大量需求不相符，另一方面發酵后產生的生物量較少，影響菌絲體中的活性物質產量。因此選育菌絲生長速度快且生物量高的靈芝菌種是解決問題的關鍵。原生質體誘變技術是一種行之有效的微生物育種新方法。目前已有靈芝原生質體誘變育種相關報道，但都已獲得較高活性物質產量為根本目的，缺少選育菌絲生長速度快、生物量高方面的研究。

發明內容

本發明的目的是要提供一種提高靈芝菌絲生長速度和液體發酵生物量的方法，解決現有技術中選育菌絲生長速度慢、生物量低的問題。

本發明的目的是這樣實現的：該方法采用靈芝為菌種，經馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基活化、液體搖瓶培養后，利用復合酶液水解靈芝菌絲體，在28~32℃下振蕩1.5~4h，制備原生質體，采用亞硝酸作為誘變劑，誘變靈芝原生質體，選擇生長速度快、菌絲雪白的再生菌落經花生粕斜面培養基、花生粕液體發酵培養基培養，獲得生物量、多糖及三萜類化合物；

具體步驟如下：

（1）配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基：按照GB4789.15—2010《食品衛生微生物學檢驗?霉菌和酵母計數》配制，用于菌種的復蘇及保存；

（2）菌種活化：取靈芝No.?5.786菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上活化1~2次；

（3）取液體培養的菌絲，過濾收集菌絲球，用無菌水沖洗2~3次，再用甘露醇沖洗2~3次，轉入巰基乙醇中，恒溫搖床振蕩30~60min，過濾收集菌絲球，用甘露醇沖洗2~3次，離心分離取沉淀為菌絲體，取菌絲體以1:10~20的比例加入復合酶液，恒溫下振蕩酶解2~4h，過濾后濾液于500~1000r/min離心3~5min，取上清液于3000~4000?r/min，離心5~10?min，沉淀即為原生質體，用甘露醇沖洗并用0.9％生理鹽水把原生質體稀釋10倍；

（4）向原生質體稀釋液中加入等量的0.06mol/LNaNO₂和1mol/L醋酸緩沖液，27℃恒溫處理5~25min，再加入兩倍于醋酸緩沖液體積的0.7mol/L?pH?8.6的Na₂HPO₄溶液終止誘變；將誘變后的原生質體分別涂在再生培養基上，27℃培養5天；

（5）將生長速度快、菌絲雪白的菌落接種在花生粕斜面培養基上，該培養基組成為玉米10~30g/L，花生粕2~5g/L，KH₂PO_4?1~3?g/L，MgSO₄·7H₂O?0.5~1.5?g/L，VB₂?0.3~0.8g/L，瓊脂20g/L。27℃培養6~7天得第一代誘變菌株，將其接種新的花生粕斜面培養基上，27℃培養6~7天得第二代誘變菌株，按同樣方法獲得第三代~第九代菌株；

（6）接種第一、三、五、七、九代菌塊于花生粕液體發酵培養基中，該培養基組成為玉米10~30?g/L，花生粕2~5?g/L，蛋白胨1~3?g/L，葡萄糖10~30?g/L，酵母膏1~3?g/L，KH₂PO_4?1~3?g/L，MgSO₄·7H₂O?0.5~1.5?g/L，pH?6.5，27℃搖床培養5~7天；

（7）分離生物量：發酵液過濾收集菌絲，60℃烘干至質量恒定并稱質量；

（8）胞內粗多糖的提取：取干菌絲體1g，加入10倍體積蒸餾水，90℃水浴2~3h，4000?r/min離心5~10min，收集上清液，沉淀再重復浸提2次，合并3次的上清液，80~90?℃水浴濃縮成原體積的0.2~0.25倍，加入4~5倍體積95%乙醇，4℃靜置，濃縮液離心，用無水乙醇洗滌沉淀兩次，烘干至恒重，得胞內粗多糖；

（9）胞內三萜類化合物的提取：取干菌絲體1g加50?mL甲醇靜置過夜后過濾，蒸干后加4?mL?95%乙醇溶解；

（10）誘變菌株放置石蠟油或砂土管中，4℃保存，每一年傳代一次。