[發明專利]一種提高靈芝菌絲生長速度和液體發酵生物量的方法

無效

• 申請號: 201210560884.7
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN102972211A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 苗敬芝;董玉瑋;陳尚龍;李勇
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: A01G1/04
• 分類號: A01G1/04;C12N15/01;C05G3/00
• 代理公司: 徐州市淮海專利事務所 32205
• 代理人: 華德明

1.一種提高靈芝菌絲生長速度和液體發酵生物量的方法，其特征是：采用靈芝為菌種，經馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基活化、液體搖瓶培養后，利用復合酶液水解靈芝菌絲體，在28~32℃下振蕩1.5~4h，制備原生質體，采用亞硝酸作為誘變劑，誘變靈芝原生質體，選擇生長速度快、菌絲雪白的再生菌落經花生粕斜面培養基、花生粕液體發酵培養基培養，獲得生物量和多糖、三萜類化合物；

具體步驟如下：

（1）配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基：按照GB4789.15—2010《食品衛生微生物學檢驗?霉菌和酵母計數》配制，用于菌種的復蘇及保存；

（2）菌種活化：取靈芝No.?5.786菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上活化1~2次；

（3）取液體培養的菌絲，過濾收集菌絲球，用無菌水沖洗2~3次，再用甘露醇沖洗2~3次，轉入巰基乙醇中，恒溫搖床振蕩30~60min，過濾收集菌絲球，用甘露醇沖洗2~3次，離心分離取沉淀為菌絲體，取菌絲體以1:10~20的比例加入復合酶液，恒溫下振蕩酶解2~4h，過濾后濾液于500~1000r/min離心3~5min，取上清液于3000~4000?r/min，離心5~10?min，沉淀即為原生質體，用甘露醇沖洗并用0.9％生理鹽水把原生質體稀釋10~15倍；

（4）向原生質體稀釋液中加入等量的0.06mol/LNaNO₂和1mol/L醋酸緩沖液，27℃恒處理5~25min，再加入兩倍于醋酸緩沖液體積的0.7mol/L?pH?8.6的Na₂HPO₄溶液終止誘變；將誘變后的原生質體分別涂在再生培養基上，27℃培養5天；

（5）將生長速度快、菌絲雪白的菌落接種在花生粕斜面培養基上，該培養基組成為玉米10~30g/L，花生粕2~5g/L，KH₂PO_4?1~3?g/L，MgSO₄·7H₂O?0.5~1.5?g/L，VB₂?0.3~0.8g/L，瓊脂20g/L。

2.27℃培養6~7天得第一代誘變菌株，將其接種新的花生粕斜面培養基上；27℃培養6~7天得第二代誘變菌株，按同樣方法獲得第三代~第九代菌株；

（6）接種第一、三、五、七、九代菌塊于花生粕液體發酵培養基中，該培養基組成為玉米10~30?g/L，花生粕2~5?g/L，蛋白胨1~3?g/L，葡萄糖10~30?g/L，酵母膏1~3?g/L，KH₂PO_4?1~3?g/L，MgSO₄·7H₂O?0.5~1.5?g/L，pH?6.5，27℃搖床培養5~7天；

（7）分離生物量：發酵液過濾收集菌絲，60℃烘干至質量恒定并稱質量；

（8）胞內粗多糖的提取：取干菌絲體1g，加入10倍體積蒸餾水，90℃水浴2~3h，4000?r/min離心5~10min，收集上清液，沉淀再重復浸提2次，合并3次的上清液，80~90?℃水浴濃縮成原體積的0.2~0.25倍，加入4~5倍體積95%乙醇，4℃靜置，濃縮液離心，用無水乙醇洗滌沉淀兩次，烘干至恒重，得胞內粗多糖；

（9）胞內三萜類化合物的提取：取干菌絲體1g加50?mL甲醇靜置過夜后過濾，蒸干后加4?mL?95%乙醇溶解；

（10）誘變菌株放置石蠟油或砂土管中，4℃保存，每一年傳代一次。