[發明專利]一種溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法

有效

• 申請號: 201210560247.X
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103063631A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 張小平;王曉晨;覃業霞
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;蘇運貞

技術領域

本發明屬于微藻粗油脂測定的技術領域，特別涉及一種溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法。

背景技術

隨著經濟的發展，人類對能源的要求越來越高，微藻被認為是制備生物柴油燃料的理想原料。藻類具有光合效率高、零凈碳值、易培養、生長周期短、油烴含量高等優點，且不與農爭地，不與人爭糧，不影響全球能源分配，其作為生物能源，已引起各國政府和學者的高度關注。微藻制備生物柴油的研究工藝包括產油微藻的篩選、微藻培養系統、微藻的收集分離、藻油的提取、微藻油脂制取生物柴油等過程。其中微藻油脂含量的測定是研究和開發高產油微藻的關鍵環節。

測定微藻藻油的方法有多種，目前對微藻總油脂測定的方法主要包括有機溶劑提取法、索氏提取法、尼羅紅熒光染料測定法、蘇丹黑B染色法、傅里葉變換紅外光譜法、磷酸香草醛法、銅試劑法、核磁共振法、超臨界CO₂提取法、離子液體提取法等和濕法提取-GCMS測定法等。

有機溶劑提取法雖然使用較普遍、易操作、成本低，但所需樣品量大、所得總脂含量較低，微藻量比較少的時候提取不到油脂或提取的油脂無法進行稱量，蒸除有機溶劑的時候容易揮發，揮發的溶劑有毒易污染環境、操作耗時費力；索氏提取法測定微藻總脂含量較準確，不足之處同樣是所需試劑和樣品量大，溶劑有毒易揮發并且污染環境，而且提取時間較長；熒光染料測定法、傅里葉變換紅外光譜法、磷酸香草醛法、銅試劑法、蘇丹黑染色法以及核磁共振法所需樣品量少、所用時間短，但仍存在不足。其中，熒光染料測定法不需要提取油脂且靈敏度高，但其易受染色不徹底、葉綠素熒光峰等各種因子的影響；傅里葉變換紅外光譜法和核磁共振法對樣品無損傷，無需或僅需很少的預處理，后者重復性好，但成本較高；磷酸香草醛測定法較穩定，但需要用到強酸如硫酸，操作比較危險；銅試劑法成本低，但對其報道極少；蘇丹黑染色法操作簡單，不需要對藻細胞破碎及化學抽提，但不適于非均勻樣品的測定，同時受藻細胞生長代謝影響，不能存放，若藻樣不能使用，則該方法測定失效，另外測定技術不夠成熟，目前多用于醫療上面的脂肪染色；超臨界CO₂提取法和離子液體提取法提取效率高，所得總脂含量比較大，但測定成本較高。

目前最常用的測定方法是熒光測定法，熒光測定法直接使用尼羅紅熒光染色法染色不夠徹底，而超聲或者二甲基亞砜（DMSO）處理-尼羅紅染色測熒光的方法雖然可以克服染色不夠徹底的問題，但是超聲或DMSO處理-熒光法測定的是藻體，當藻體培養到一定時間后就需要及時測定，不能長期存放，若是實驗失敗，就需要重新養藻；而提取的藻油可以存放，若實驗測定失敗，還可以再次配置測定。再者，當藻液濃度大時，直接用藻體測熒光容易受葉綠素熒光峰的干擾，同時不同的藻樣的葉綠素含量不同，受葉綠素熒光峰的影響更大。因此，選擇一個快速、簡便、高效、靈敏的測定方法具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，包括如下步驟：

（1）標準曲線的制作：取微藻，離心后取沉淀，用PBS緩沖液清洗干凈，然后用PBS緩沖液稀釋成藻液，作為標準藻液；取5份19.8mL標準藻液，分別加入200μL異丙醇、180μL異丙醇+20μL三油精、160μL異丙醇+40μL三油精、140μL異丙醇+60μL三油精、120μL異丙醇+80μL三油精，配制不同濃度的三油精溶液；分別往三油精溶液中依次加入二甲基亞砜和尼羅紅染色20分鐘，測定各三油精溶液的熒光強度，以吸光度為縱坐標、三油精溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程；二甲基亞砜的體積濃度為20%，尼羅紅的濃度為0.3μg/mL；

（2）微藻油脂的提取：取干燥的微藻，加入2mol/L?KOH-CH₃OH溶液，65℃～85℃水浴加熱8～15min，冷卻至室溫后加入2mol/L?HCl-CH₃OH溶液，65℃～85℃水浴加熱8～15min，冷卻至室溫后加入正己烷，靜置，分層，取正己烷層，得到待測溶液；每克微藻加入4～8mL2mol/L的KOH-CH₃OH溶液，每克微藻加入8～16mL2mol/L的HCl-CH₃OH溶液，每克微藻加入4～8mL正己烷；