[發明專利]一種溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法

有效

• 申請號: 201210560247.X
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103063631A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 張小平;王曉晨;覃業霞
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;蘇運貞

1.一種溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）標準曲線的制作：取微藻，離心后取沉淀，用PBS緩沖液清洗干凈，然后用PBS緩沖液稀釋成藻液，作為標準藻液；取5份19.8mL標準藻液，分別加入200μL異丙醇、180μL異丙醇+20μL三油精、160μL異丙醇+40μL三油精、140μL異丙醇+60μL三油精、120μL異丙醇+80μL三油精，配制不同濃度的三油精溶液；分別往三油精溶液中依次加入二甲基亞砜和尼羅紅染色20分鐘，測定各三油精溶液的熒光強度，以吸光度為縱坐標、三油精溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程；二甲基亞砜的體積濃度為20%，尼羅紅的濃度為0.3μg/mL；

（2）微藻油脂的提取：取干燥的微藻，加入2mol/L?KOH-CH₃OH溶液，65℃～85℃水浴加熱8～15min，冷卻至室溫后加入2mol/L?HCl-CH₃OH溶液，65℃～85℃水浴加熱8～15min，冷卻至室溫后加入正己烷，靜置，分層，取正己烷層，得到待測溶液；每克微藻加入4～8mL2mol/L的KOH-CH₃OH溶液，每克微藻加入8～16mL2mol/L的HCl-CH₃OH溶液，每克微藻加入4～8mL正己烷；

（3）熒光測定微藻油脂的含量：將0.2mL步驟（2）制備的待測溶液加入19.8mL步驟（1）制備的標準藻液中，得到樣品藻液；將0.2mL正己烷加入19.8mL步驟（1）制備的標準藻液中，得到空白樣品；分別往樣品藻液、空白樣品中依次加入二甲基亞砜和尼羅紅染色20分鐘，分別測定樣品藻液、空白樣品的熒光強度，樣品藻液的熒光強度減去空白樣品的熒光強度，得到待測溶液的熒光強度，由回歸方程計算待測溶液中微藻油脂的濃度，計算微藻油脂的含量。

2.根據權利要求1所述的溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的微藻為生長至對數末期的新鮮微藻。

3.根據權利要求1所述的溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的PBS緩沖液采用以下方法進行配制：將磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）0.27g、磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄）1.42g、氯化鈉（NaCl）8g和氯化鉀（KCl）0.2g加800mL去離子水中，充分攪拌溶解后加入濃鹽酸調pH至7.4，最后定容到1L，高溫高壓滅菌后室溫保存，得到PBS緩沖液。

4.根據權利要求1所述的溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的離心的條件4000～5000r/min，離心5～10min。

5.根據權利要求1所述的溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的藻液的吸光度為0.200～1.000。

6.根據權利要求1所述的溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的熒光強度的測定條件為激發波波長488nm、發散光范圍400～700nm、狹縫寬度為10nm和電壓值400V。

7.根據權利要求1所述的溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的二甲基亞砜的體積濃度是指二甲基亞砜的體積與（二甲基亞砜+三油精溶液）總體積的百分比。

8.根據權利要求1所述的溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步驟（2）中所述的2mol/L?KOH-CH₃OH溶液為含有2mol/L?KOH的甲醇溶液；所述的2mol/L?HCl-CH₃OH溶液為含有2mol/L?HCl的甲醇溶液。

9.根據權利要求1所述的溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步驟（2）中所述的靜置的時間為10min。

10.根據權利要求1所述的溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步驟（3）中所述的二甲基亞砜的體積濃度是指二甲基亞砜的體積與（二甲基亞砜+三油精溶液）總體積的百分比；所述的熒光強度的測定條件為激發波波長488nm、發散光范圍400～700nm、狹縫寬度為10nm和電壓值400V。