[發(fā)明專利]熒光定量PCR檢測豇豆I型和II型耐旱性的方法以及診斷性基因和引物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210559678.4
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN103045738A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐沛;李國景;吳曉花;汪寶根;魯忠富;羅潔;王莎;劉永華
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/29;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及熒光定量PCR檢測豇豆I型和II型耐旱性的方法以及診斷性基因和引物。

背景技術(shù)

豇豆（Vigna?unguiculata?L.?Walp）起源于非洲干旱地區(qū)，是世界范圍內(nèi)重要的糧食豆類和亞洲國家重要蔬菜作物之一。據(jù)2006年統(tǒng)計(jì)年鑒，我國豇豆年產(chǎn)量達(dá)800萬噸以上，而由于干旱造成的產(chǎn)量損失估計(jì)達(dá)20%左右。豇豆的耐旱性在不同基因型之間存在顯著差異。前人研究表明豇豆自然資源中存在著兩種不同類型的耐旱反應(yīng)，即I型和II型耐旱響應(yīng)（Watanabe?et?al.,?1997;?Muchero?et?al.,?2008;?Agbicodo?et?al.,?2009）。在I型耐旱響應(yīng)中，植物在水分脅迫下各組織迅速關(guān)閉氣孔、停止生長并保持各組織水分含量大致相當(dāng)，并在復(fù)水后才恢復(fù)生長；與此相反，II型耐旱品種的老葉快速干枯死亡，并且將其中水分運(yùn)送至新葉并保持新葉氣孔開張和繼續(xù)生長，直到土壤水分繼續(xù)下降至相當(dāng)?shù)偷呐R界值（圖1）。由于這兩類耐旱機(jī)制的顯著不同，在豇豆耐旱育種中需要事先明確將要利用的育種親本材料的耐旱類型，然后有針對性的設(shè)計(jì)育種方案和制定育種計(jì)劃。

基因表達(dá)的調(diào)節(jié)對生物性狀的形成和變化具有至關(guān)重要的作用。在干旱脅迫下，大批植物基因如轉(zhuǎn)錄因子、脫水素蛋白、水通道蛋白、ABA合成相關(guān)因子基因等都會(huì)發(fā)生表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào)。模式植物中的大量研究表明，有些基因在干旱脅迫的表達(dá)調(diào)控模式在不同耐旱類型材料中特異地表現(xiàn)出差異，從而可以作為區(qū)分各種耐旱類型的診斷性基因。目前，豇豆中尚未報(bào)道或開發(fā)過可用于特異檢測I型和II型耐旱性的診斷性基因及其引物。

檢測基因表達(dá)的常用方法傳統(tǒng)的有Northern雜交法，較新的有實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、表達(dá)譜芯片法等。表達(dá)譜芯片是一種高通量檢測方法，一次可對上萬條基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，適于從大量基因中篩選出與植物生長發(fā)育、環(huán)境脅迫、抗病蟲害等相關(guān)的目標(biāo)基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR通常一次檢測一個(gè)基因，但簡便、經(jīng)濟(jì)，一般實(shí)驗(yàn)室均可操作。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種熒光定量PCR檢測豇豆I型和II型耐旱性的方法，通過簡單的熒光定量PCR即可區(qū)分豇豆品種的不同耐旱類型，分析過程在1-2日內(nèi)即可完成，大大提高了效率，有利于有針對性的利用不同耐旱類型的育種親本，促進(jìn)豇豆耐旱育種。本發(fā)明的第二個(gè)目的是一種特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因。本發(fā)明的第三個(gè)目的是一種特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因的熒光定量PCR引物。

為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

熒光定量PCR檢測豇豆I型和II型耐旱性的方法，該方法被檢測的診斷基因的序列如SEQ?ID?NO:1所示；所述的熒光定量PCR引物具有以下的序列：

上游引物：5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'；

下游引物：5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。

作為優(yōu)選，該方法包括以下的步驟：

1）材料準(zhǔn)備：挑選飽滿的1份I型耐旱豇豆品種?和1份II型耐旱豇豆品種種子播于營養(yǎng)缽，基質(zhì)為蛭石：營養(yǎng)土=3：1；待子葉平展時(shí)澆透水后停止灌水，于處理后14天用常規(guī)Trizol法提取正常生長和受脅迫條件下的葉部RNA；或者拔出植株根部，迅速用水洗凈后用常規(guī)Trizol法提取正常生長和受脅迫條件下的根部RNA；

2）RAN提取和反轉(zhuǎn)錄：取葉片或根組織組織0.1g加液氮研磨成粉末，參照試劑盒說明書提取總RNA；將提取的RNA用DEPC處理過的水稀釋至0.1?g/L，在8μL?DEPC處理過的水中依次加入2μL?錨定引物AP、RNA?2μL；將上述混合物置于70℃溫浴5?min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5×第一鏈緩沖液4μL、0.25mmol/L?dNTP?2.5μL、0.1?mol/L?DTT?2.5μL、200?u/μL?的SUPERSCRIPTⅡ反轉(zhuǎn)錄酶0.4μL；25℃?5?min，42℃?15?min，70℃?10?min，4℃保持；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存；cDNA稀釋10倍備用；

所述的第一鏈緩沖液包括：250?mmol/L?Tris-HCl、pH8.3、375?mmol/L?KCl、15?mmol/L?MgCl₂；