[發(fā)明專利]熒光定量PCR檢測豇豆I型和II型耐旱性的方法以及診斷性基因和引物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210559678.4
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103045738A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐沛;李國景;吳曉花;汪寶根;魯忠富;羅潔;王莎;劉永華
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/29;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

1.熒光定量PCR檢測豇豆I型和II型耐旱性的方法，其特征在于該方法被檢測的診斷基因的序列如SEQ?ID?NO:1所示；熒光定量PCR引物具有以下的序列：

上游引物：5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'；

下游引物：5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR檢測豇豆I型和II型耐旱性的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟：

1）材料準(zhǔn)備：挑選飽滿的1份I型耐旱豇豆品種?和1份II型耐旱豇豆品種種子播于營養(yǎng)缽，基質(zhì)為蛭石：營養(yǎng)土=3：1；待子葉平展時(shí)澆透水后停止灌水，于處理后14天用常規(guī)Trizol法提取正常生長和受脅迫條件下的葉部RNA；或者拔出植株根部，迅速用水洗凈后用常規(guī)Trizol法提取正常生長和受脅迫條件下的根部RNA；

2）RAN提取和反轉(zhuǎn)錄：取葉片或根組織組織0.1g加液氮研磨成粉末，參照試劑盒說明書提取總RNA；將提取的RNA用DEPC處理過的水稀釋至0.1?g/L，在8μL?DEPC處理過的水中依次加入2μL?錨定引物AP、RNA?2μL；將上述混合物置于70℃溫浴5?min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5×第一鏈緩沖液4μL、0.25mmol/L?dNTP?2.5μL、0.1?mol/L?DTT?2.5μL、200?u/μL?的SUPERSCRIPTⅡ反轉(zhuǎn)錄酶0.4μL；25℃?5?min，42℃?15?min，70℃?10?min，4℃保持；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存；cDNA稀釋10倍備用；

所述的第一鏈緩沖液包括：250?mmol/L?Tris-HCl、pH8.3、375?mmol/L?KCl、15?mmol/L?MgCl₂；

3）熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)：采用八連PCR管為單位進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR；PCR體系包括：10μL2×Mix，5.4μL?ddH₂O，2μL?50×ROX，0.6μL?引物和2μL?cDNA，為20μL體系；?PCR程序?yàn)椋孩倜讣せ?5℃?15min，擴(kuò)增循環(huán)②95℃?15s，③55℃?30s，④72℃?32s，②-④共40個(gè)循環(huán)；

溶解曲線分析為：95℃?15s，60℃?1min；

每組PCR均做3次重復(fù)，取平均值進(jìn)行計(jì)算；內(nèi)參基因的序列如SEQ?ID?NO:4所示；數(shù)據(jù)分析采用2^-ΔΔC_T法；結(jié)果表明利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)獲得了與芯片表達(dá)譜相一致的SEQ?ID?NO:1基因差異表達(dá)模式，從而能夠?qū)型和II型耐旱性材料明確區(qū)分出來。

3.特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因，其特征在于該基因的序列如SEQ?ID?NO:1所示。

4.用于診斷權(quán)利要求3所述的特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因的熒光定量PCR引物，其特征在于該引物具有以下的序列：

上游引物：5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'；

下游引物：5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。