[發明專利]一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌、其構建方法及應用

無效

• 申請號: 201210557205.0
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103074291A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 高鳳山
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/40;C12N15/74;C07K16/10;A61K39/42;A61P31/14;C12R1/46
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌、其構建方法及應用。

背景技術

豬流行性腹瀉(Porcine?epidemic?diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine?epidemicdiarrhea?virus,PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐和脫水為特征的豬腸道傳染病(Bi?et?al.2012;Pan?etal.2012;Song?and?Park?2012)。從2010年以來，豬流行性腹瀉病開始在全國流行，導致仔豬腹瀉，甚至死亡，給養豬業造成了嚴重的損失(毛雅元2010)。目前，傳統的豬流行性腹瀉疫苗已經不能完全控制疫情的傳播和發生。在此情況下，研制新型的豬流行性腹瀉疫苗非常必要。

PEDV纖突（spike,S）糖蛋白攜帶主要的B淋巴細胞抗原表位，是誘導機體產生中和抗體和提供免疫保護作用的主要結構蛋白(Duarte?and?Laude?1994;Chang?et?al.2002)。實踐證明，腸道黏膜免疫所產生的分泌型抗體(sIgA)是抵抗PEDV感染的有效抗體。其中，PEDV?S糖蛋白中COE基因被證明是主要的抗原保護性基因(Kang?et?al.2005)。

乳酸乳球菌(Lactococcus?lactis)是一種易通過黏膜吸收的常在菌，適量的乳酸菌對維持腸道菌群平衡具有積極意義。NIZO公司近年來開發了乳酸乳球菌載體表達系統，在該載體上表達的外源基因很容易通過黏膜吸收，另外，該載體為食品級，不含有任何抗生素基因或其他有害成分(de?Ruyter?et?al.1997;Hernandez?et?al.2007;Chen?et?al.2011)。利用該表達系統研制的疫苗，不僅具有良好的免疫效果，而且具有易吸收、無副作用的特點。

發明內容

根據目前國內外關于豬流行性腹瀉病毒防治研究的現狀和疫苗研制的最新進展，本發明提出一種采取目前NIZO公司提供的最新乳酸乳球菌表達載體pNZ8149（含有乳糖基因）來裝載PEDV的免疫保護性抗原S(COE)基因，并轉化入缺失乳糖表達基因的乳酸乳球菌，構建重組菌，該重組菌的篩選不需要抗生素，也不含有任何對宿主細胞有害的生物因素，屬于生物安全級的載體。然后將構建的重組菌免疫原接種小鼠，測定其體重增長、抗體產生及細胞免疫應答等情況，以衡量疫苗的免疫效果，本發明在豬流行性腹瀉病毒乳酸菌載體疫苗方面有廣闊的應用前景。

本發明的技術方案如下：RT-PCR擴增獲得豬流行性腹瀉病毒（PEDV）主要保護性抗原COE基因序列，并將其克隆測序。根據測序結果和表達載體特點，設計表達引物，擴增PEDVCOE編碼序列，并將其連接至乳酸乳球菌表達載體pNZ8149，電轉化入乳酸乳球菌NZ3900細胞內。重組菌以1ng/mL乳鏈菌肽（Nisin）誘導，通過SDS-PAGE和Western?blot分析，PEDV主要S蛋白獲得了表達。表達的重組菌經不同免疫方式接種4周齡小鼠，一周后采血應用ELISA方法檢測血清中的PEDV抗體及IFN-γ，評價PEDV乳酸菌疫苗刺激產生的體液免疫與細胞免疫。同時，在免疫前后測定小鼠體重，評價疫苗對小鼠生長發育的影響。結果顯示各免疫組對小鼠體重增加沒有負影響，且略有增加；免疫后，10倍稀釋口服組小鼠刺激產生的PEDV抗體最高，同時該組刺激產生的血清中IFN-γ也最高。該PEDV乳酸菌載體口服疫苗能夠刺激小鼠產生體液免疫和一定的細胞免疫。

本發明的技術方案及意義：

PEDV感染具有明顯的腸道嗜性。腸道黏膜表面sIgA含量的高低直接決定疾病的發生和嚴重程度[2～7]。本發明成功地克隆了PEDV主要保護性抗原基因COEN，通過序列比較分析，這株PEDV主要S基因核苷酸序列同已發表的Brl/87株PEDV相應序列同源性達到99.44％，說明該基因序列比較保守，可以作為PEDV基因工程疫苗的候選基因。Tae-Jin將PEDV?Brl/87株中和抗原基因(K-COE)在煙草中表達，動物試驗證實有良好的抗原性(Kang?et?al.2005)。

本發明針對PED免疫特點,在試驗設計上以阻斷腸道傳染性疾病病原感染的第一道防線為目的,利用安全無毒的乳酸菌表達系統在腸道黏膜上粘附、定植和表達及傳遞抗原物質,因而抗原物質對黏膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途徑。因此，所產生的黏膜免疫保護效果將更為理想。