[發明專利]一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌、其構建方法及應用

無效

• 申請號: 201210557205.0
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103074291A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 高鳳山
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/40;C12N15/74;C07K16/10;A61K39/42;A61P31/14;C12R1/46
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

1.一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌的構建方法，其特征在于，包括步驟有：

①利用引物序列SEQ?ID?NO.1~2，對豬流行性腹瀉病毒主要保護性抗原COE基因序列進行擴增，將擴增后的產物，連接至pMD?18-T載體中；

②以步驟①獲得的重組載體為模板，利用引物序列SEQ?ID?NO.3~4進行PCR擴增，將PCR產物經Nco?I與Sac?I酶切、凝膠回收純化后與經相同酶切、純化后的載體pNZ8149連接；

③將步驟②獲得的重組質粒電轉化入乳酸乳球菌NZ3900細胞內獲得陽性重組菌。

2.根據權利要求1所述的重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌的構建方法，其特征在于，所述的步驟①中，基因序列擴增條件為：94℃預變性5min,94℃變性1min,54℃退火1min,72℃延伸1min，共30個循環。

3.根據權利要求1所述的重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌的構建方法，其特征在于，所述的步驟②是指，用引物SEQ?ID?NO.3/4擴增含有COE的編碼區片段，PCR產物經Nco?I與Sac?I酶切、凝膠回收純化后與經相同酶切、純化后的載體pNZ8149連接。

4.如權利要求1所述的方法構建的重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌。

5.一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌表達PEDV特異性抗體的方法，其特征在于，包括步驟有：將權利要求1方法獲得的陽性重組菌，接種于L-SGM17B培養基中，30℃培養過夜，取過夜培養產物以1∶25比例接種于L-SGM17B培養基中，30℃培養至OD600達到0.4~0.6；用1ng/mL的乳鏈桿菌肽誘導2～3h。

6.如權利要求5所述的方法表達的PEDV特異性抗體在制備重組豬流行性腹瀉病毒疫苗藥物中的應用。