[發(fā)明專利](R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210556375.7
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103014082A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鞠鑫;尹將來;張超
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛(wèi);汪青

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制藥和綠色化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法

背景技術(shù)

阿托伐他汀(atorvastatin，商品名立普妥，Lipitor)是世界上第一個年銷售額超過百億美元的藥品。它通過抑制羥甲基戊二酰CoA還原酶，阻礙肝臟中膽固醇合成的限速步驟來降低血液中膽固醇的含量。

現(xiàn)在工藝的關(guān)鍵步驟是利用(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(A4)一步法合成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(A5)(Angew.Chem.Int.Ed.2005,44:362-365)。

在該步反應(yīng)中，由于生物法避免了化學(xué)法中存在的堿性條件下形成副產(chǎn)物過多，分離純化困難的缺點(diǎn)，因此利用鹵代醇脫鹵酶(halohydrin?dehalogenase，HHDH)從A4合成A5的工藝已經(jīng)被研究。美國專利US?7125693和US?7132267公布了Codexis公司對于該項(xiàng)目的研究，其酶投料量為底物的1.5%(w/w)，粗收率為93%。之后國內(nèi)的專利CN?102168117A對該工藝進(jìn)行了改良，實(shí)現(xiàn)了氰化鈉的回收利用，但是其酶投料量高達(dá)底物的8.0%(w/w)，粗收率僅為83.8%。

綜合以上文獻(xiàn)檢索信息，我們發(fā)現(xiàn)目前存在的工藝中，存在著酶用量過高，反應(yīng)條件不適當(dāng)?shù)热毕荨?/p>

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種改進(jìn)的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，該底物在生物催化劑的作用下，與氰化鈉反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，所述的生物催化劑為重組鹵代醇脫鹵酶，所述的重組鹵代醇脫鹵酶的制備方法為：將鹵代醇脫鹵酶單菌落接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30-40℃下?lián)u床活化8-12小時，將活化后得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30-40℃下擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6-0.8，加入誘導(dǎo)劑，于25-35℃繼續(xù)培養(yǎng)8-12小時，離心收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰浴中超聲波破碎8-12分鐘，再離心，分離上清液，將上清液預(yù)凍至溫度為-10~-25℃，然后再凍干24-48小時，即得重組鹵代醇脫鹵酶，所述的反應(yīng)在pH為6-8的水相中進(jìn)行。

進(jìn)一步地，在起始時的反應(yīng)體系中，所述的底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的濃度為150-200mg/ml，所述的重組鹵代醇脫鹵酶為底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的0.4-1%（w/w）。

進(jìn)一步地，在起始時的反應(yīng)體系中，所述的氰化鈉與所述的底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的摩爾比為1.5-2.5:1。

進(jìn)一步地，反應(yīng)結(jié)束后底物的轉(zhuǎn)化率為98-100%，產(chǎn)物光學(xué)純度大于99%，純度大于97%。

優(yōu)選地，所述的反應(yīng)在pH為7.0的水相中進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述的反應(yīng)中所述的重組鹵代醇脫鹵酶為底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的0.5%（w/w）。

優(yōu)選地，所述的反應(yīng)中底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的濃度為200mg/ml。

優(yōu)選地，所述的誘導(dǎo)劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖。

進(jìn)一步地，所述的制備方法的實(shí)施過程如下：在反應(yīng)容器中依次加入水，底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，攪拌均勻后慢慢滴加氰化鈉溶液，再加入重組鹵代醇脫鹵酶，在40-60℃下攪拌反應(yīng)，利用GC檢測反應(yīng)進(jìn)程，待轉(zhuǎn)化率大于98%時，加入硫酸調(diào)節(jié)pH至2-3，加入乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)品。

根據(jù)本發(fā)明，除重組鹵代醇脫鹵酶，其余原料均可由通用渠道商購獲得。

本發(fā)明的有益效果在于:

本發(fā)明通過采用重組鹵代醇脫鹵酶催化反應(yīng)并通過對工藝的優(yōu)化，使得底物濃度提高，酶用量降低，從而降低了生產(chǎn)成本，并且使得產(chǎn)品的純度和收率都有所提高。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的反應(yīng)式如下：

下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)的技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例一