[發(fā)明專利](R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210556375.7
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN103014082A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鞠鑫;尹將來;張超
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12P13/00
• 分類號(hào): C12P13/00
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛(wèi);汪青

1.?一種(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，該底物在生物催化劑的作用下，與氰化鈉反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，其特征在于：所述的生物催化劑為重組鹵代醇脫鹵酶，所述的重組鹵代醇脫鹵酶的制備方法為：將鹵代醇脫鹵酶單菌落接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30-40℃下?lián)u床活化8-12小時(shí)，將活化后得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30-40℃下擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6-0.8，加入誘導(dǎo)劑，于25-35℃繼續(xù)培養(yǎng)8-12小時(shí)，離心收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰浴中超聲波破碎8-12分鐘，再離心，分離上清液，將上清液預(yù)凍至溫度為-10~-25℃，然后再凍干24-48小時(shí)，即得重組鹵代醇脫鹵酶，所述的反應(yīng)在pH為6-8的水相中進(jìn)行。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于：在起始時(shí)的反應(yīng)體系中，所述的底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的濃度為150-200?mg/ml，所述的重組鹵代醇脫鹵酶為底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的0.4-1%（w/w）。

3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于：在起始時(shí)的反應(yīng)體系中，所述的氰化鈉與所述的底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的摩爾比為1.5-2.5：1。

4.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于：所述的反應(yīng)在pH為7.0的水相中進(jìn)行。

5.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于：所述的誘導(dǎo)劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖。

6.?根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于：所述的制備方法的實(shí)施過程如下：在反應(yīng)容器中依次加入水，底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，攪拌均勻后慢慢滴加氰化鈉溶液，再加入重組鹵代醇脫鹵酶，在40-60℃下攪拌反應(yīng)，利用GC檢測反應(yīng)進(jìn)程，待轉(zhuǎn)化率大于98%時(shí)，加入硫酸調(diào)節(jié)pH至2-3，加入乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)品。