[發(fā)明專利]一種棕櫚酸輔酶A的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210554748.7
• 申請(qǐng)日: 2012-12-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103074400A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京利德曼生化股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/32
• 分類號(hào): C12P19/32;C12N15/52;C12N15/63;C12N1/21;C12N9/00;C12R1/19
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1.一種制備棕櫚酸輔酶A的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）克隆編碼乙酰輔酶A合成酶的基因并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，獲得表達(dá)乙酰輔酶A合成酶的基因工程菌株；

（2）將步驟（1）的基因工程菌株種子接入發(fā)酵初始培養(yǎng)基進(jìn)行初始培養(yǎng)；

（3）初始培養(yǎng)結(jié)束后，加入誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生乙酰輔酶A合成酶；

（4）誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后加入十二烷基磺酸鈉至其終濃度為0.05～0.15g/L進(jìn)行預(yù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)；預(yù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)完成后流加轉(zhuǎn)化補(bǔ)料培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，得到棕櫚酸輔酶A。

2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的編碼乙酰輔酶A合成酶的基因的核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示，其編碼的氨基酸序列為SEQ?ID?No.2所示。

3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2）中所述的發(fā)酵初始培養(yǎng)基組成包括：磷酸氫二銨6-12g/L、磷酸二氫鉀3-6g/L、一水檸檬酸0.2-1g/L、硫酸鎂?0.3-2?g/L、微量元素母液1-3ml/L、葡萄糖10-20g/L、硫酸卡那霉素50mg/L；pH值為6.5-7.3;

所述微量元素的母液的按照以下方法配制得到：

（1）按以下用量稱取各成分：10g?FeSO₄．7H₂O，2.25g?ZnSO₄.7H₂O，1g?CuSO₄.5H₂O，0.5gMnSO4.5H₂O,?0.23g?Na₂B₄O₇.10H₂O，2g?CaCl₂.2H₂O，0.1g?(NH₄)₆Mo₇O₂₄；（2）將上述各成分溶于1L?5M鹽酸中，即得。

4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3）中初始培養(yǎng)結(jié)束后降溫至28℃，加入誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生乙酰輔酶A合成酶；當(dāng)菌液OD600的值為40-50，酶活為20KU/L時(shí)停止誘導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)階段。

5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成為：甘油200-400g/L?、乳糖70?-130g/L，硫酸銨100-200g/L；pH值為4.5。

6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（4）中所述的預(yù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的培養(yǎng)條件包括：通氣量為0.5L/L發(fā)酵液/min，轉(zhuǎn)速為200～300rpm，溫度保持在28℃；pH值為6.1～6.3。

7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（4）中預(yù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)30min后開(kāi)始流加轉(zhuǎn)化補(bǔ)料培養(yǎng)基。

8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的轉(zhuǎn)化補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成成分包括：甘油50-150?g/L，棕櫚酸鈉?100-300g/L。

9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的流加轉(zhuǎn)化補(bǔ)料培養(yǎng)基的方式包括：流加速度初始時(shí)設(shè)定為1ml/h/L發(fā)酵液，1h后調(diào)整為3ml/h/L發(fā)酵液，1.5h后調(diào)整為5ml/h/L發(fā)酵液，2h后調(diào)整為7ml/h/L發(fā)酵液，保持7ml/h/L的流速。

10.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（4）的補(bǔ)料過(guò)程中，通過(guò)調(diào)整通氣量將溶解氧含量控制在30%左右。