[發明專利]一種棕櫚酸輔酶A的制備方法

有效

• 申請號: 201210554748.7
• 申請日: 2012-12-19
• 公開（公告）號: CN103074400A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 北京利德曼生化股份有限公司
• 主分類號: C12P19/32
• 分類號: C12P19/32;C12N15/52;C12N15/63;C12N1/21;C12N9/00;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及一種酶的制備方法,尤其涉及一種采用發酵方式制備棕櫚酸輔酶A的方法,屬于棕櫚酸輔酶A的制備領域。

背景技術

棕櫚酸輔酶A是棕櫚酸與輔酶A合成的產物，可以用于生物化學等多重領域。現有的棕櫚酸輔酶A的生產方法主要有化學合成法與酶轉化法。化學合成法存在合成步驟多收率低等缺點，酶轉化法需要用到輔酶A（CoA）、ATP，因為輔酶A（CoA）、ATP價格昂貴，故棕櫚酸輔酶A的酶轉化法的成本很高，有待改進。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有酶轉化法制備棕櫚酸輔酶A的所存在的成本高的缺陷，提供一種成本較低的制備棕櫚酸輔酶A的方法。

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：

一種制備棕櫚酸輔酶A的方法，包括以下步驟：

（1）克隆編碼乙酰輔酶A合成酶的基因并將其轉化到大腸桿菌細胞中進行表達，獲得表達乙酰輔酶A合成酶的基因工程菌株；

（2）將步驟（1）的基因工程菌株種子接入發酵初始培養基進行初始培養直至初始培養基中營養耗盡，溶氧上升至50%以上；

（3）初始培養結束后，加入誘導補料培養基進行誘導培養產生乙酰輔酶A合成酶；

（4）誘導培養結束后加入十二烷基磺酸鈉(SDS)至其終濃度為0.05～0.15g/L，進行預轉化培養；預轉化培養完成后流加轉化補料培養基繼續進行轉化培養，得到棕櫚酸輔酶A。

其中，步驟（1）中從施氏假單胞菌（ATCC?17588）中克隆得到編碼乙酰輔酶A合成酶的基因，將此基因在大腸桿菌BL21（DE3）進行表達，獲得表達乙酰輔酶A合成酶的基因工程菌株；所述的編碼乙酰輔酶A合成酶的基因的核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示，其編碼的氨基酸序列為SEQ?ID?No.2所示。

步驟（2）中所述的發酵初始培養基組成包括：磷酸氫二銨6-12g/L、磷酸二氫鉀3-6g/L、一水檸檬酸0.2-1g/L、硫酸鎂?0.3-2?g/L、微量元素母液1-3ml/L、葡萄糖10-20g/L、硫酸卡那霉素50mg/L；2M硫酸與氨水做為酸堿調節pH值為6.5-7.3；

所述微量元素的母液的按照以下方法配制得到：（1）按以下用量稱取各成分：10g?FeSO₄．7H₂O，2.25g?ZnSO₄.7H₂O，1g?CuSO₄.5H₂O，0.5gMnSO4.5H₂O,?0.23g?Na₂B₄O₇.10H₂O，2g?CaCl₂.2H₂O，0.1g?(NH₄)₆Mo₇O₂₄；（2）將上述各成分溶于1L?5M鹽酸中，即得。

步驟（3）中初始培養結束后降溫至28℃，加入誘導補料培養基進行誘導培養產生乙酰輔酶A合成酶；

所述的誘導補料培養基的組成為：甘油200-400g/L?、乳糖70?-130g/L，硫酸銨100-200g/L；pH值為4.5。

步驟（3）中當菌液OD600的值為40-50，酶活為20KU/L時停止誘導培養轉入轉化培養階段。

步驟（4）中所述的預轉化培養的培養條件包括：通氣量為0.5L/L發酵液/min，轉速為200～300rpm，溫度保持在28℃；使用2M硫酸和氫氧化鈉調節pH值為6.1～6.3；

步驟（4）中預轉化培養30min后開始流加轉化補料培養基；

所述的轉化補料培養基的組成成分包括：甘油50-150?g/L，棕櫚酸鈉?100-300g/L；

所述的流加轉化補料培養基的方式包括：流加速度初始時設定為1ml/h/L發酵液，1h后調整為3ml/h/L發酵液，1.5h后調整為5ml/h/L發酵液，2h后調整為7ml/h/L發酵液，保持此流速。

步驟（4）的補料過程中，通過調整通氣量將溶解氧含量控制在30%左右。