[發(fā)明專利]6-氰基-（3R,5R）-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210554535.4
• 申請日: 2012-12-19
• 公開（公告）號: CN103014080A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 樂庸堂;鞠鑫;梁長輝;莊繼昌
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛(wèi);汪青

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物制藥和綠色化學領(lǐng)域，具體涉及一種6-氰基-（3R,5R）-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法。

背景技術(shù)：

降膽固醇的他汀類藥物是目前世界最暢銷的藥物大類。2010年世界最暢銷藥物，輝瑞公司的立普妥(商品名稱Lipitor，年銷售額119億美元)有效活性為阿托伐他汀(atorvastatin)(Nature?2012,485:185-194)。6-氰基-（3R,5R）-二羥基己酸叔丁酯是用于合成此類降膽固醇他汀類藥物的關(guān)鍵手性中間體。目前可以通過化學法或酶法加以制備(Angew.Chem.Int.Ed.2005,44:362-365)。

目前化學法工藝生產(chǎn)6-氰基-（3R,5R）-二羥基己酸叔丁酯是利用硼烷類衍生物在-70攝氏度以下的條件下將6-氰基-（5R）-羥基-3-氧代己酸叔丁酯還原。該工藝需要極端反應(yīng)條件，易燃，能耗嚴重并且產(chǎn)品的立體異構(gòu)純度只能達到98%(US?2009/0216029A1)。

美國的科德克希思公司開發(fā)的合成路線是利用源于釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）的基因工程改造的酮還原酶催化從6-氰基-（5R）-羥基-3-氧代己酸叔丁酯到6-氰基-（3R,5R）-二羥基己酸叔丁酯的還原反應(yīng)，同時利用一種葡萄糖脫氫酶完成輔酶（NADPH）的再生反應(yīng)。通過該工藝路線可以獲得立體異構(gòu)純的6-氰基-（3R,5R）-二羥基己酸叔丁酯（de值大于99%）（WO?2008/042876A2）。

但是該工藝中存在著底物濃度較低，酶用量較大等問題，例如在該專利中制備產(chǎn)物的實例中，其初始底物濃度為300mg/mL，酶粉用量為底物的1.2%，輔酶用量為底物的0.05%，該種用量使得生產(chǎn)成本較高。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種改進的6-氰基-（3R,5R）-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種6-氰基-（3R,5R）-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法，其以6-氰基-（5R)羥基-3-氧代己酸叔丁酯為底物，該底物在生物催化劑、輔因子和輔因子再生系統(tǒng)的存在下發(fā)生還原反應(yīng)生成6-氰基-（3R,5R）-二羥基己酸叔丁酯，所述的生物催化劑為酮還原酶，所述的輔因子再生系統(tǒng)包括葡萄糖和葡萄糖脫氫酶，所述的還原反應(yīng)在pH為6~8的水相緩沖液中進行，在起始時的反應(yīng)體系中，所述的底物6-氰基-（5R)-羥基-3-氧代己酸叔丁酯的濃度為350~400mg/mL，所述的酮還原酶與所述的底物6-氰基-（5R)-羥基-3-氧代己酸叔丁酯的質(zhì)量比為0.005~0.04:1。

進一步地，在起始時的反應(yīng)體系中，所述的輔因子：所述的葡萄糖：所述的葡萄糖脫氫酶;所述的6-氰基-（5R)-羥基-3-氧代己酸叔丁酯的質(zhì)量比為0.0005~0.002：0.9~1.8：0.01~0.04：1。

進一步地，所述的輔因子為NAD/NADH或NADP/NADPH。

優(yōu)選地，所述的輔因子為NADP/NADPH。

優(yōu)選地，所述的水相緩沖液為三乙醇胺鹽酸緩沖溶液。

優(yōu)選地，所述的還原反應(yīng)在pH為7.0的水相緩沖液中進行。

進一步地，所述的制備方法的實施過程如下：在反應(yīng)容器中依次加入葡萄糖、所述的水相緩沖液，攪拌均勻，繼續(xù)加入底物6-氰基-（5R)-羥基-3-氧代己酸叔丁酯，攪拌均勻，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6~8，再繼續(xù)加入葡萄糖脫氫酶和酮還原酶，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH6~8，再加入所述的輔因子，用氫氧化鈉溶液維持pH6~8，攪拌反應(yīng)，利用LC-MS檢測反應(yīng)進程，待轉(zhuǎn)化率達90~99%時，結(jié)束反應(yīng)。

本發(fā)明所采用的酮還原酶（蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司，KRED101）、葡萄糖脫氫酶（蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司，GDH102）均可商購獲得。

本發(fā)明的有益效果在于:

本發(fā)明通過對工藝條件的優(yōu)化，提高底物濃度，降低酶用量，從而降低了生產(chǎn)成本，實現(xiàn)了高效率的生物轉(zhuǎn)化過程，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

具體實施方式：

本發(fā)明的反應(yīng)式如下：

下面的實施例可以使本專業(yè)的技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實施例一：反應(yīng)監(jiān)測方法