[發明專利]煙葉微生物選擇性培養基配制及培養煙葉微生物的方法

無效

• 申請號: 201210554417.3
• 申請日: 2012-12-19
• 公開（公告）號: CN103014122A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 周麗娟;薛紅芬;史云濤;周芳芳;王娟;張曉龍;資文華;鄧國賓
• 申請（專利權）人: 云南瑞升煙草技術（集團）有限公司
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12N1/20;C12N1/14
• 代理公司: 昆明大百科專利事務所 53106
• 代理人: 李云

1.?煙葉微生物選擇性培養基的配制方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）制備煙葉提取物：取廢棄煙葉或煙葉碎末500g加10-15倍水提取2-4h，提取完成后將提取液過濾進行減壓濃縮，濃縮至其相對密度d2020為1.053±0.008、折光指數Nd20為1.372±0.008，放置于4℃溫度保存使用；

（2)?制作煙葉選擇性培養基，包括：

a、制作煙葉細菌選擇性培養基：配制煙葉細菌選擇性培養基的配方為牛肉膏2.5-3.5?g/L、蛋白胨9-10?g/L、NaCl5-6g/L?、煙葉提取物15-20g/L、瓊脂10-15g/L、余量為水；煙葉細菌選擇性培養基的pH7.0-7.2；將配制好的煙葉細菌選擇性培養基于115℃滅菌30分鐘，臨用前待煙葉細菌選擇性培養基稍冷至40-50℃時，加入10-15μg/L潮霉素B稀釋液，混勻后倒板；

b、制作煙葉真菌選擇性培養基：配制煙葉真菌選擇性培養基的配方為葡萄糖9-12g/L、蛋白胨4-6g/L、KH₂PO₄0.8-1.2g/L、MgSO₄.7H₂O0.4-0.6?g/L、煙葉提取物15-20g/L、1/3000孟加拉紅90-120?ml、瓊脂10-15?g?/L、余量為水；煙葉真菌選擇性培養基的pH按自然所得；將配制好的煙葉真菌選擇性培養基于115℃滅菌20分鐘，臨用前待煙葉真菌選擇性培養基稍冷至40-50℃時，加入8-12?mg/L的鏈霉素稀釋液混勻后倒板；

c、制作煙葉放線菌選擇性培養基：配制煙葉放線菌選擇性培養基的配方為可溶性淀粉15-20?g/L、KH₂PO₄0.3-0.5?g/L、MgSO₄.7H₂O0.3-0.5?g/L、KNO₃0.8-1.0g/L、FeSO₄.7H₂O0.008-0.01?g/L、NaCl0.3-0.5?g/L、煙葉提取物15-20g/L、瓊脂10-15?g/L、余量為水；配制時，需先將可溶性淀粉加少量冷水調制成糊狀，再加入沸水中；煙葉放線菌選擇性培養基的pH7.2-7.4；將配制好的煙葉放線菌選擇性培養基于115℃滅菌30分鐘，臨用時在已滅菌的培養基中加入45-60?mg/L的重鉻酸鉀溶液，搖勻后倒板。

2.利用權利要求1所述選擇性培養基培養煙葉微生物的方法，其特征在于，稱取10g新鮮或4℃保存的煙樣置于盛有90mL無菌的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌三角瓶內，放入適量玻璃珠，于150r/min?轉速下震蕩30min，靜置20min，制成1:10的一次樣品勻液；用1mL無菌吸管或微量移液器吸取一次樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中且吸管或吸頭尖端不觸及稀釋液面，振搖無菌試管或換用1支無菌吸管反復吹打使一次樣品勻液與稀釋液混合均勻，制成1:100的二次樣品勻液；以此類推，制備得到10倍系列稀釋的十次樣品勻液；每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭；選擇2個～3個樣品勻液，吸取0.1mL樣品勻液涂布于煙葉細菌選擇性培養基或煙葉真菌選擇性培養基或煙葉放線菌選擇性培養基上，每個稀釋度做三個平皿；細菌于30℃±1℃培養2-3d；真菌于28℃±1℃培養3-4d；放線菌于28℃±1℃培養4-5d，即得到煙葉微生物。