[發明專利]煙葉微生物選擇性培養基配制及培養煙葉微生物的方法

無效

• 申請號: 201210554417.3
• 申請日: 2012-12-19
• 公開（公告）號: CN103014122A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 周麗娟;薛紅芬;史云濤;周芳芳;王娟;張曉龍;資文華;鄧國賓
• 申請（專利權）人: 云南瑞升煙草技術（集團）有限公司
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12N1/20;C12N1/14
• 代理公司: 昆明大百科專利事務所 53106
• 代理人: 李云

技術領域

本發明專利屬于煙葉微生物的選擇性培養技術領域。

背景技術

煙葉醇化的發酵過程中有微生物、酶及化學物質的協同作用，誘發一系列與香氣物質變化有關?的生化反應。其中微生物貫穿煙葉發酵始終，很多致香物質都是通過微生物的生化代謝途徑而獲得的。因此，煙葉微生物區系的檢測對于提高煙葉品質相關的醇化技術研究起著較為重要的作用。

微生物區系主要包括三大類：細菌、真菌、放線菌。隨著科學技術的進步，檢測微生物區系的技術手段也越來越豐富，但目前主要集中于分子技術鑒定法及傳統平板培養法兩種方法。傳統分子技術所需要的儀器、試劑、耗材等比較昂貴，克隆測序成本較高、操作較繁瑣，周期長，而且通過傳統分子技術手段僅能做到定性，難做定量。而采用新型的用熒光定量分子技術進行定量，其檢測成本將更加高昂。因此，分離和統計這三類微生物數量較為快速經濟、簡便易行的方法仍然是平板培養法，它主要是利用不同營養成分的固體培養基對煙葉微生物進行選擇性培養，然后根據菌落形成單位(CFU)和菌落形態來分析鑒定微生物種類，該法的核心及關鍵在于選擇性培養基的分離效果。而現有用于微生物區系的選擇性培養基大都是針對土壤微生物區系來設計的，因此對于煙葉微生物的培養適宜性以及抗生素適用性都較差，從而影響了煙葉微生物的培養及分離效，最終導致檢測結果偏離真實值。

發明內容

本發明的目的是解決現有技術的問題，提供一種煙葉微生物選擇性培養基的配制方法以及培養煙葉微生物的方法，以煙葉微生物的培養及分離為出發點，針對性的設計煙葉微生物區系檢測中所涉及的真菌、細菌、放線菌進行選擇性培養基的配方設計，提供一種能夠解決傳統選擇性培養基培養不完全以及分離效果差的方法，并且為檢測結果的準確性及檢測操作的便利性提供支持。

本發明的目的通過如下技術方案實現。

煙葉微生物選擇性培養基的配制方法，包括如下步驟：

（1）制備煙葉提取物：取廢棄煙葉或煙葉碎末500g加10-15倍水提取2-4h，提取完成后將提取液過濾進行減壓濃縮，濃縮至其相對密度d2020為1.053±0.008、折光指數Nd20為1.372±0.008，放置于4℃溫度保存使用；

（2)?制作煙葉選擇性培養基，包括：

a、制作煙葉細菌選擇性培養基：配制煙葉細菌選擇性培養基的配方為牛肉膏2.5-3.5?g/L、蛋白胨9-10?g/L、NaCl5-6g/L?、煙葉提取物15-20g/L、瓊脂10-15g/L、余量為水；煙葉細菌選擇性培養基的pH7.0-7.2；將配制好的煙葉細菌選擇性培養基于115℃滅菌30分鐘，臨用前待煙葉細菌選擇性培養基稍冷至40-50℃時，加入10-15μg/L潮霉素B稀釋液，混勻后倒板；

b、制作煙葉真菌選擇性培養基：配制煙葉真菌選擇性培養基的配方為葡萄糖9-12g/L、蛋白胨4-6g/L、KH₂PO₄0.8-1.2g/L、MgSO₄.7H₂O0.4-0.6?g/L、煙葉提取物15-20g/L、1/3000孟加拉紅90-120?ml、瓊脂10-15?g?/L、余量為水；煙葉真菌選擇性培養基的pH按自然所得；將配制好的煙葉真菌選擇性培養基于115℃滅菌20分鐘，臨用前待煙葉真菌選擇性培養基稍冷至40-50℃時，加入8-12?mg/L的鏈霉素稀釋液混勻后倒板；

c、制作煙葉放線菌選擇性培養基：配制煙葉放線菌選擇性培養基的配方為可溶性淀粉15-20?g/L、KH₂PO₄0.3-0.5?g/L、MgSO₄.7H₂O0.3-0.5?g/L、KNO₃0.8-1.0g/L、FeSO₄.7H₂O0.008-0.01?g/L、NaCl0.3-0.5?g/L、煙葉提取物15-20g/L、瓊脂10-15?g/L、余量為水；配制時，需先將可溶性淀粉加少量冷水調制成糊狀，再加入沸水中；煙葉放線菌選擇性培養基的pH7.2-7.4；將配制好的煙葉放線菌選擇性培養基于115℃滅菌30分鐘，臨用時在已滅菌的培養基中加入45-60?mg/L的重鉻酸鉀溶液，搖勻后倒板。