[發(fā)明專利]6條寡核苷酸序列及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210552569.X
• 申請(qǐng)日: 2012-12-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103060326A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭江;湯學(xué)敏;李玉寶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 集美大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 廈門(mén)南強(qiáng)之路專利事務(wù)所 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及溶藻弧菌的識(shí)別檢測(cè)，尤其是涉及6條可用于溶藻弧菌識(shí)別檢測(cè)的寡核苷酸序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

在養(yǎng)殖業(yè)中，每年約有10％的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物死于感染性病害，其中弧菌感染導(dǎo)致的疾病占了相當(dāng)大的比重。雖然化學(xué)藥品和抗生素可控制其感染，但是藥物防治常會(huì)產(chǎn)生不良后果，如在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)積累、殘留，容易產(chǎn)生耐藥菌株和易污染環(huán)境等問(wèn)題，因此建立病原弧菌的快速檢測(cè)技術(shù)，以提早防治病害的發(fā)生和流行仍是目前的主要手段。

目前，弧菌的檢測(cè)方法主要是根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)，通過(guò)對(duì)微生物的生理生化特征檢測(cè)進(jìn)行鑒定，由于需要測(cè)試的項(xiàng)目較多，因此該方法工作量較大、操作較繁瑣。16SRNA的分子生物學(xué)方法雖有較高的準(zhǔn)確性，但需要提取病原菌的16SRNA，手續(xù)較繁瑣，且對(duì)檢測(cè)設(shè)備有一定要求，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)需要；免疫學(xué)方法制備的抗血清雖能實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，但由于制備的抗血清為多克隆抗體，實(shí)際應(yīng)用中可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，即使采用單克隆抗體。由于制備技術(shù)要求較高、周期較長(zhǎng)，因此其應(yīng)用受到限制。

指數(shù)富集配體進(jìn)化技術(shù)（Systemic?Evolution?ofLigands?by?Exponential?Enrichment），簡(jiǎn)稱SELEX技術(shù)，是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種系統(tǒng)篩選技術(shù)。它利用寡核苷酸分子可在空間形成多種多樣的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)構(gòu)建的隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，從中篩選出與目標(biāo)靶分子有特異識(shí)別作用的高親和力的寡核苷酸分子——適配子，其分子識(shí)別能力可達(dá)到甚至超過(guò)了單克隆抗體的水平，而制備技術(shù)則比單克隆抗體簡(jiǎn)單、快速。運(yùn)用該技術(shù)目前已篩選出腫瘤細(xì)胞、炭疽桿菌等的適配子，可用于腫瘤細(xì)胞和炭疽桿菌的檢測(cè)、識(shí)別。

SELEX技術(shù)的出現(xiàn)為微生物的快速檢測(cè)提供了新的研究思路，其應(yīng)用也將越來(lái)越廣泛。在SELEX篩選中，以滅活菌為靶目標(biāo)進(jìn)行篩選，不僅具有較好的安全性，而且使目標(biāo)菌的形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定和固定，從而有效提高了篩選的效率和效果。同時(shí)，以滅活菌為靶目標(biāo)，還能有效避免環(huán)境因子對(duì)活菌的影響，使篩選的穩(wěn)定性得到較好的改善。因此，開(kāi)展以滅活菌為靶目標(biāo)的SELEX篩選，具有重要意義。

溶藻弧菌是一種廣泛分布于世界各地海水及河口處的一種病原微生物，其數(shù)量居海水類弧菌之首，存在于多種海洋動(dòng)物中，是魚(yú)、蝦、貝等海水養(yǎng)殖動(dòng)物的條件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部發(fā)炎等疾病，對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成十分嚴(yán)重的威脅。因此，運(yùn)用SELEX技術(shù)篩選滅活溶藻弧菌適配子，并將其應(yīng)用于滅活溶藻弧菌的識(shí)別鑒定，能大大提高溶藻弧菌檢測(cè)的靈敏度和特異性，成為本發(fā)明的重點(diǎn)。

本申請(qǐng)人在中國(guó)專利201110090419.7中已公開(kāi)了4條適配子序列，分別如下：

8號(hào)適配子：5′-TCAGTCGCTT?CGCCGTCTCC?TTCAGAGTCG?TGGAGAGGGTGAACGGAGGG?GGGAAACAGC?ACAAGAGGGA?GACCCCAGAG?GG-3′

10號(hào)適配子：5′-TCAGTCGCTT?CGCCGTCTCC?TTCAGGTGGC?GAGTTGCGAAGGACTGTGTC?GAGTGTTGGC?ACAAGAGGGA?GACCCCAGAG?GG-3′

37號(hào)適配子：5′-TCAGTCGCTT?CGCCGTCTCC?TTCAGCGGGA?TGAGGGAGTAGGAGGGCCAC?AGTGGACTGC?ACAAGAGGGA?GACCCCAGAG?GG-3′

46號(hào)適配子：5′-TCAGTCGCTT?CGCCGTCTCC?TTCCAGTCGC?TTCGCCGCCTCCTTCCCTCT?GGGGTCTC-3′。

本申請(qǐng)人在中國(guó)專利201110259244.8中已公開(kāi)了3條適配子序列，分別如下：

序列1：5′-GAGACCCCAG??AGGGAAGGAG??GCGGCGAAGC??GACTGGAAGGAGACGGCGAA?GCGACTGA-3′；

序列2：5′-TCAGTCGCTT??CGCCGTCTCC??TTCCAGTCGC??TTCGCCGCCTCCTTCCCTCT?GGGGTCTCCC?TCTTGTGC-3′；

序列3：5′-GCACAAGAGG??GAGACCCCAG??AGGGAAGGAG??GCGGCGAAGCGACTGGAAGG?AGACGGCGAA?GCGACTGA-3′。

發(fā)明內(nèi)容