[發明專利]豬偽狂犬病毒的培養方法

無效

• 申請號: 201210550961.0
• 申請日: 2012-12-18
• 公開（公告）號: CN103865886A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 張述智;夏偉;朱紹輝;張浩;王曉麗;徐權汗;李之詳;許團輝
• 申請（專利權）人: 青島中仁藥業有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

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技術領域

本發明屬于豬偽狂犬病毒疫苗生產技術領域，具體涉及用細胞培養技術培養豬偽狂犬病毒的方法。

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背景技術

豬偽狂犬病(Porcine?Pseudorabies,?PR)是由偽狂犬病病毒(Porcine?pseudorabies?virus,?PRV)引起的以發熱和腦脊髓炎為主要特征的急性、發熱性傳染病。該病可引起豬、牛、羊、犬、貓、家兔、小白鼠、水貂、狐等多種家畜和野生動物發病，具有高致死率。而豬是該病毒增殖感染唯一可存活的宿主，是該病毒的自然儲存庫。所以，從豬群中切斷偽狂犬病毒的傳播是控制偽狂犬病的有效途徑。成年豬一般呈隱性感染，引起生長停滯，增重緩慢等；懷孕母豬可導致流產、死胎、木乃伊等綜合癥；7日齡以內的仔豬發病死亡率可達100?%，斷奶仔豬發病率可達20?%～40%。

目前，該病分布于全世界50多個國家和地區，我國已有23個省(市)報道了該病的發生，給畜牧業造成了巨大的損失。因此必須對該病進行有效的預防和控制，最根本的措施是疫苗接種，而疫苗效果好壞主要取決于抗原的制備，抗原的制備又大多采用細胞增殖病毒的方法，但由于該病毒在不同的細胞上增殖效果不盡相同，出現病變的時間、病變特征、病變觀察的難易程度、病毒含量均有所差別，如不能掌握其規律選擇最佳的細胞系進行病毒的培養，將難以生產出優質的疫苗的。

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發明內容

為了克服現有技術領域存在的上述缺陷，本發明的目的在于，提供一種豬偽狂犬病毒的培養方法，解決現有技術采用細胞增殖病毒的方法制備抗原，不容易掌握病毒的規律選擇最佳細胞進行病毒培養的問題。

本發明提供的豬偽狂犬病毒的培養方法，包括以下步驟：

（1）細胞傳代，將BHK-21細胞用胰酶-EDTA溶液進行消化，待細胞松動后，加入DMEM細胞培養液，并用吸管將消化下來的細胞吹散均勻，倒出4/5的細胞懸液，再加入等量的DMEM細胞培養液，即將細胞密度稀釋為原來的5倍；

（2）病毒增殖，將PRV毒種2?%單層接種BHK-21，并同時設未接毒的正常對照細胞，37℃孵育1h后，加入細胞維持液，置37℃、5%CO₂培養箱培養，觀察CPE出現的時間及特征，當細胞出現80?%?CPE時收毒，凍融3次，1500?r/min離心l5min，小瓶分裝上清液備用，按此方法傳代至第3代，-70?℃冰柜保存備用；

它還包括以下步驟：將所述步驟（2）中增殖后的第3代PRV病毒液用含10?%血清的DDMEM細胞培養液進行10倍系列稀釋，取10^-4～10^-9?6個稀釋度接種單層BHK-21細胞的96孔微量培養板各8孔，每孔100μl，同時設細胞對照孔，置37℃、5%CO₂培養箱培養，觀察6日，按Reed-Muench法計算TCID₅₀；將所述步驟（2）中增殖后的第3代PRV病毒液用含2%血清的DMEM培養液做1000倍稀釋，與等量PRV標準陽性血清1:128混合，置37℃水浴中和1h后分別接種相對應的細胞，同時設病毒對照、空白對照及陽性血清對照，置37℃、5%CO₂培養箱觀察6日，觀察各組細胞有無CPE。

本發明提供的豬偽狂犬病毒的培養方法，其有益效果在于，該方法具有工藝簡便、生長量大、得率高、成本低廉的特點，并且利用本發明培養的豬偽狂犬病毒制備的疫苗對豬偽狂犬病毒病具有完全的防治作用，具有很好的社會效益和應用前景；所培養的病毒液病毒含量需不低于10^7.0?TCID₅₀/0.1ml,顯著高于現行技術培養的豬偽狂犬病毒的毒價；所用細胞BHK-21細胞為普通的常用細胞，來源充足，獲取成本低，培養技術成熟，易于生產。

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具體實施方式

下面結合一個實施例，對本發明提供的豬偽狂犬病毒的培養方法進行詳細的說明。

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實施例

本實施例的豬偽狂犬病毒的培養方法，包括以下步驟：

（1）細胞傳代，將BHK-21細胞用胰酶-EDTA溶液進行消化，待細胞松動后，加入DMEM細胞培養液，并用吸管將消化下來的細胞吹散均勻，倒出4/5的細胞懸液，再加入等量的DMEM細胞培養液，即將細胞密度稀釋為原來的5倍；