[發明專利]豬偽狂犬病毒的培養方法

無效

• 申請號: 201210550961.0
• 申請日: 2012-12-18
• 公開（公告）號: CN103865886A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 張述智;夏偉;朱紹輝;張浩;王曉麗;徐權汗;李之詳;許團輝
• 申請（專利權）人: 青島中仁藥業有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種豬偽狂犬病毒的培養方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）細胞傳代，將BHK-21細胞用胰酶-EDTA溶液進行消化，待細胞松動后，加入DMEM細胞培養液，并用吸管將消化下來的細胞吹散均勻，倒出4/5的細胞懸液，再加入等量的DMEM細胞培養液，即將細胞密度稀釋為原來的5倍；

（2）病毒增殖，將PRV毒種2?%單層接種BHK-21，并同時設未接毒的正常對照細胞，37℃孵育1h后，加入細胞維持液，置37℃、5%CO2培養箱培養，觀察CPE出現的時間及特征，當細胞出現80?%?CPE時收毒，凍融3次，1500?r/min離心l5min，小瓶分裝上清液備用，按此方法傳代至第3代，-70?℃冰柜保存備用。

2.根據權利要求1所述的豬偽狂犬病毒的培養方法，其特征在于：它還包括以下步驟：將所述步驟（2）中增殖后的第3代PRV病毒液用含10?%血清的DDMEM細胞培養液進行10倍系列稀釋，取10-4～10-9?6個稀釋度接種單層BHK-21細胞的96孔微量培養板各8孔，每孔100μl，同時設細胞對照孔，置37℃、5%CO2培養箱培養，觀察6日，按Reed-Muench法計算TCID50。

3.根據權利要求1所述的豬偽狂犬病毒的培養方法，其特征在于：它還包括以下步驟：

將所述步驟（2）中增殖后的第3代PRV病毒液用含2%血清的DMEM培養液做1000倍稀釋，與等量PRV標準陽性血清1:128混合，置37℃水浴中和1h后分別接種相對應的細胞，同時設病毒對照、空白對照及陽性血清對照，置37℃、5%CO2培養箱觀察6日，觀察各組細胞有無CPE。