[發(fā)明專利]水稻基因BADH2的定點敲除系統(tǒng)及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210548714.7
• 申請日: 2012-12-17
• 公開（公告）號: CN103013954A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高彩霞;單奇?zhèn)?/a>;陳坤玲
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/63;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/82;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種水稻基因BADH2的定點敲除系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

香味是優(yōu)質(zhì)稻米重要特征之一，在世界范圍內(nèi)展開廣泛的研究。已將控制米香的基因定位在水稻第8號染色體上，位于分子標(biāo)記RM515和SSRJ07之間約386kb范圍內(nèi)。Bradbury等（2005）發(fā)現(xiàn)在香米和普通米之間一個存在序列差異的基因——BADH2，這一基因編碼甜菜堿乙醛脫氫酶（betaine?aldehyde?dehydrogenase），推測可能與米香的合成有關(guān)。Chen等（2008）對通過轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實驗證明了BADH2基因控制米香，香米品種BADH2基因的第二個或第七個外顯子存在天然突變，沒有全長的BADH2轉(zhuǎn)錄本，2AP(2-acetyl-1-pyrroline，水稻香米芳香成分之一)大量積累；而只有在普通稻米中存在全長的BADH2轉(zhuǎn)錄本，其中2AP含量極低。通過在香米品種中轉(zhuǎn)入全長的BADH2基因，其2AP含量顯著降低，香氣丟失。證明BADH2是控制米香的主效基因。

TALENs（轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶）是近幾年出現(xiàn)的基因定點修飾新技術(shù)，在動物、植物和人類等領(lǐng)域都有廣泛的研究和應(yīng)用。轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（Transcription?Activator-Like?Protein?Effector,TALE）是黃單胞菌屬病原菌分泌到宿主植物細(xì)胞中的一種毒性蛋白，可以識別植物DNA，驅(qū)動基因表達(dá)。TALENs就是利用TALE的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Fok?I的DNA切割結(jié)構(gòu)域人工合成的核酸酶。兩個TALEN單體按照一定方式結(jié)合在DNA雙鏈上，形成有切割活性的二聚體將DNA切斷，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB），細(xì)胞啟動修復(fù)機(jī)制，通過非同源末端連接（NHEJ）這種不精確的修復(fù)方式可以產(chǎn)生基因定點突變，通過同源重組（HR）方式修復(fù)可以實現(xiàn)精確的基因定點插入或基因替換。相比鋅指核酸酶（ZFNs）和Meganucleases技術(shù)，TALENs技術(shù)具有設(shè)計簡單，突變效率高和細(xì)胞毒性低等優(yōu)勢。TALENs的優(yōu)異性取決于TALE獨(dú)特的DNA識別特性。TALEN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含了一個由數(shù)量不等（1.5—33.5）的重復(fù)單元組成的串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域。每一個重復(fù)單元通常由33—35個氨基酸組成，重復(fù)單元的氨基酸高度保守，但是各個單元的第12和13位兩個相鄰氨基酸是可變的，這兩個氨基酸通常被稱為重復(fù)可變雙殘基（Repeat-variable?diresidue，RVD）。每個RVD與核苷酸A、T、C、G存在簡單對應(yīng)的關(guān)系，最常見的識別密碼為NI識別A、HD識別結(jié)合C、NG識別結(jié)合T和NN識別G（Moscou?and?Bogdanove.,2009）。

目前，香米品種的培育都是利用雜交方式將香米基因轉(zhuǎn)入普通稻米中，盡管可以借助分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，但這個過程復(fù)雜周期較長。通過TALENs定點敲除技術(shù)可以直接將優(yōu)質(zhì)稻米（非香米）中BADH2基因定點突變或敲除，創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)香米，大大縮短育種周期。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種水稻基因BADH2的定點敲除系統(tǒng)及其應(yīng)用。

所述水稻基因BADH2的定點敲除系統(tǒng)，為如下a）或b）或c）：

a）由T-BADH2b和T-BADH2a組成；

b）T-BADH2b；

c）T-BADH2a；

所述T-BADH2b為特異剪切所述水稻基因BADH2內(nèi)靶序列B的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶；所述靶序列B由間隔序列b、位于所述間隔序列b?5’端的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶的模塊識別序列L-b和位于所述間隔序列b?3’端的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶的模塊識別序列R-b組成；所述間隔序列b為水稻基因BADH2中包含序列表序列1第1612位至第1617位（BglⅡ酶切識別序列）的長為15—20bp（如18bp）的序列；所述模塊識別序列L-b的長為15—30bp（如17bp）,所述模塊識別序列R-b的長為15—30bp（如17bp）；所述T-BADH2b單獨(dú)使用，可將所述水稻基因BADH2定點剪切并產(chǎn)生定點突變，使所述水稻基因BADH2失去原有的功能；